检测百香果木质化病毒病的RT-PCR引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于果类检疫性病害检测技术领域，特别涉及一种检测早期百香果木质化病毒病的rt-pcr引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

随着广西百香果的良好市场形势和种植年份的丰收，百香果已在许多地方普及，成为“短、平、快”的精准扶贫项目。近年来广西百香果种植面积不断扩大，2016年为17.8万亩，2017年为30万亩，2018年为41万亩。由于种植管理普遍粗放、不注重源头选苗，果农对病虫害没有进行及时的防治等原因，大多数果园疫病、茎基腐病、病毒病等发生普遍，导致了广西百香果种植的产量和品质偏低。其中百香果木质化病是百香果最为重要的病毒病害，该病表现为叶片皱缩、畸形、花叶，植株长势弱小，果皮变厚变硬、瘤状突起，果实木质化和严重畸形。严重影响了百香果的产量和品质，已成为制约产业发展的重要因素。国内百香果木质化病毒病最早发现于台湾地区，目前在国内其它百香果种植地区也相继发现了木质化病毒侵染的植株，产业发展面临潜在威胁。广西南宁市武鸣区、贵港市、崇左市等百香果种植产业区，特别是连年种植3年以上的基地，木质化病毒病发病较为严重。

无病毒苗木繁育及推广是保障百香果产业持续、健康发展的基础，而病毒检测是无毒苗繁育、推广的关键技术之一。

病毒检测方法包括生物学检测、电子显微镜检测和血清学检测。生物学检测耗时长，且受环境条件限制。电子显微镜检测结果直观、准确，由于仪器设备昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人技术水平要求高，因此并没有得到广泛应用。血清学方法具有快速、直观等特点，但其结果的准确性往往依赖于抗血清的品质，且无法检测不稳定的病毒。

反转录聚合酶链反应(rt-pcr)是20世纪90年代发展起来的一种检测植物rna病毒的方法，该方法灵敏度高、取样量少、特异性强，适用于病毒样品的批量检测。基于以上优势，rt-pcr已广泛应用于多种植物病毒的检测。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，通过设计百香果木质化病毒(passionfruitwoodinessvirus,pwv)外壳蛋白基因片段的特异性引物，应用rt-pcr技术扩增目的基因片段，从而实现对病毒的准确检测。rt-pcr技术的样品需求量少、技术难度小、准确性高、适用于大规模样品分析。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种检测百香果木质化病毒病的rt-pcr引物组，包括特异引物pwv-f和特异引物pwv-r，所述特异引物pwv-f具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述特异引物pwv-r具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

一种检测百香果木质化病毒病的rt-pcr引物组的试剂盒，反应体系包含以下成分：2×pcrbufferforkodfx12.5μl，2mmdntps5.0μl，pwv-f(10μmol·l^-1)0.75μl，pwv-r(10μmol·l^-1)0.75μl，kodfx(1.0u·μl^-1)0.5μl，cdna第一链3.0μl，ddh2o2.5μl。

其中，所述的pwv-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，所述的pwv-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列。

上述的检测百香果木质化病毒病的rt-pcr引物组在检测百香果木质化病毒病中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明建立了一套百香果木质化病毒分子检测方法，可用于脱毒苗和田间感病植株的早期鉴定，为无病毒良种苗木繁育及推广提供技术支撑，保障百香果产业的持续、健康发展；丰富、完善百香果木质化病毒检测技术，为侵染植株中病毒含量及迁移规律研究奠定基础；为抗病育种及病害防治提供理论依据。本发明方法样品需求量少、技术难度小、准确性高、适用于大规模样品分析；不仅能诊断疑似百香果木质化病毒侵染症状的样品，还能鉴定病毒处于潜伏阶段而未表现出明显症状的样品，能实现感病植株的早期诊断。

附图说明

图1是本发明待测病果样品1的照片。

图2是本发明待测病果样品2的照片。

图3是本发明待测病果样品3的照片。

图4是本发明实施例中凝胶电泳检测的结果示意图，其中m表示dnamaker1000bp；1～3表示待测病果样品1～3；4表示阴性对照(脱毒苗)；5表示空白对照(ddh2o)。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的试剂、溶液等若无特别说明，均为市售所得。实施例中采用的病果样品为发明人在广西武鸣区、贵港市、崇左市百香果种植产业区采集的疑似百香果木质化病毒侵染的病果样品。

实施例1

木质化病毒侵染的百香果总rna的提取：

(1)取百香果木质化病毒侵染叶片100mg，用液氮充分研磨后转移至2ml离心管中，加入1mlinvitrogen公司的trizol试剂，充分混匀后室温孵育5分钟，以利于样品充分裂解，得裂解液；

(2)按每1mltrizol试剂添加0.2ml氯仿的比例在步骤(1)中所得裂解液中加入氯仿，小心盖好样品管盖，上下剧烈震荡15秒后室温孵育2-3分钟，在4℃低温下12,000×g离心15分钟；

(3)离心后管中液体分为3层，小心吸取上层无色水相转移至新的无rnase的1.5ml离心管中，然后加入0.5ml异丙醇，室温孵育10分钟，在4℃低温下12,000×g离心10分钟；

(4)离心后样品总rna形成白色凝胶状沉淀于管底，小心吸去上清后，加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀，在4℃低温下7500×g离心5分钟；

(5)离心后弃上清，开盖室温晾干rna沉淀5-10分钟，加入20-50μldepc处理的灭菌水溶解rna，备用。

实施例2

cdna第一链的合成：

(1)在无rnase的pcr管中加入总rna4μl和浓度为10μmol·l^-1的序列为cktgcagtrtgcctttcagt的木质化病毒病检测特异引物1μl，并用depc处理过的灭菌水补充体积至12μl，得混合液；

(2)将步骤(1)中所得混合液置于pcr仪中65℃孵育5分钟后，立即冰浴2分钟，然后在混合液中加入5×reactionbuffer4μl、ribonucleaseinhibitor(50u/μl)1μl、dntpmix(10mm)2μl、m-mulvreversetranscriptase(200u/μl)1μl，离心混匀，置于pcr仪中42℃孵育60分钟；然后85℃孵育5分钟，结束反应，即获得cdna第一链。

实施例3

百香果木质化病毒rt-pcr检测：

(1)引物的设计

根据百香果木质化病毒外壳蛋白基因序列保守区，采用primerpremier5.0软件进行特异引物设计，引物扩增产物大小为365bp，名称和序列如下：

上游引物pwv-f:5’-gtgtgggtratgatggatgg-3’

下游引物pwv-r:5’-cktgcagtrtgcctttcagt-3’

(2)在以下pcr反应体系中进行pcr反应：2×pcrbufferforkodfx12.5μl,2mmdntps5.0μl,pwv-f(10μmol·l^-1)0.75μl,pwv-r(10μmol·l^-1)0.75μl,kodfx(1.0u·μl^-1)0.5μl,cdna第一链3.0μl,ddh2o2.5μl。

(3)在pcr仪中设置以下反应程序：94℃预变性2min，使模板cdna充分变性；然后进入扩增循环98℃变性10s，53℃退火30s，68℃延伸48s，进行30个循环后；68℃整体延伸7min，使pcr产物延伸完整；于10℃保存待用。

(4)将所得的pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳处理，电压120v，电泳时间30分钟，得到含有目标片段的凝胶。

实施例4

pcr产物的回收纯化：

用组培刀片切取含有目标片段的凝胶，放置于2.0ml离心管中，称重；加入4倍体积凝胶重量(mg)的胶块溶解液buffergm，37℃金属浴10分钟；待胶块完全溶解后，用移液枪将胶液转移至离心柱，12,000rpm离心1分钟，弃滤液；在离心柱中加入700μl清洗液bufferwb，室温12,000rpm离心30秒，弃滤液；再次12,000rpm离心1分钟，彻底去除残留的bufferwb；将离心柱转移至新的1.5ml离心管上，开盖晾干1分钟；在离心柱的膜中央处加入30μl灭菌水，室温静置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱dna片段，得到纯化的pcr产物。

实施例5

pcr产物的ta克隆及测序验证：

在pcr管中加入4μl纯化的pcr产物和1μl克隆载体质粒peasy-bluntsimplecloningvector(10ng/μl)，轻轻混合后在pcr仪上25℃孵育10分钟进行连接反应，反应结束后置于冰上，得到连接产物。连接产物导入大肠杆菌trans-t1感受态细胞，于含100mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基上筛选；37℃过夜培养，挑取白色单菌落，以通用引物m13进行pcr扩增验证其阳性；阳性单克隆于含100mg/l氨苄青霉素的lb液体培养基中，200rpm、37℃培养12个小时，质粒提取，然后使用通用引物m13f、t7进行序列测定。测序序列与ncbi数据库上百香果木质化病毒cp基因一致性为95％～98％，可以确定扩增到的核酸片段就是百香果木质化病毒cp基因序列的一部分，说明pcr引物特异性很好。

实施例6

应用例

2018年7月，研究人员调查广西武鸣区、贵港市、崇左市百香果种植产业区病害情况，发现疑似植物病毒侵染的病果(如图1～图3所示)。依据文献报道中对百香果木质化病毒病的症状描述，研究人员只能猜测病果可能受百香果木质化病毒侵染。由于豇豆蚜传花叶病毒等侵染百香果，也会引起类似的果实轻微畸形症状，所以无法确定病原就是木质化病毒。通过上述实施例1～5所述方法，不到一周就鉴定出病原物就是百香果木质化病毒，检测结果如图4所示，待测病果样品1～3扩增到百香果木质化病毒外壳蛋白基因片段，而脱毒植株则无法扩增到该基因序列。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110>广西壮族自治区农业科学院

<120>检测百香果木质化病毒病的rt-pcr引物组、试剂盒及其应用

<130>中誉威圣

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence(人造序列)

<400>1

gtgtgggtratgatggatgg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence(人造序列)

<400>2

cktgcagtrtgcctttcagt20