食用菌生产菌种保藏方法及其活化方法与流程

本发明涉及一种食用菌生产菌种保藏方法，适用于各种类型的食用菌，如杏鲍菇、草菇、金针菇、白玉菇等品种。本发明还涉及上述食用菌生产菌种保藏方法获得的菌种的活化方法。

背景技术：

食用菌营养丰富，味美健康，是有机绿色食品，食用菌菌种相当于作物生产中的种子，菌种的质量质量直接影响着栽培结果，即产量的高低，是生产经济效益的关键因素之一。在食用菌栽培过程中，菌种的继代经常会出现因遗传物质发生改变，导致的“退化”现象，如产量低、质量差、出菇晚、抗性弱等。菌种退化不是某一次传代突然出现的，也不是短时间发生的，只有群体中退化菌丝在数量上占一定优势后才能表现的，是从量变到质变的渐变结果，需要较长的时间。食用菌产量和质量的下降是食用菌菌种退化的最终结果。

目前，普遍认为菌种保藏期间的保藏方法不当和过度传代是引起食用菌菌种退化的主要原因。对此，企业普遍采用纯种菌种的保藏、控制传代次数(如，有的企业严格规定生产用的菌种不能超过5代)、普遍采用低温保存菌种(如高温型菌种在16℃下保存，低温型菌种在4℃保存)以及定期分离菌种的主动出击的措施，保持菌种的优良性状。其次，仍有大部分企业采取被动的方法，主要是在大量制备种包(或保存斜面)的基础上，通过经验观察，从大量的培养物中寻找尚未退化的种包，进行生产，维持产品的质量和产量的稳定。

(1)采用纯种菌种的保藏、控制传代次数、低温保存的方法，这一方法是传统的微生物菌种保藏方法。对于常规科研院所实验室，这一方法是适用且有效的，因为实验室的设备较齐全，具备无菌程度较高的无菌室、超低温冰箱或液氮储罐，这些都是这一方法有效实施的前提。但对于现阶段国内的食用菌企业，拥有自己实验室的企业就为数不多，具有上述设备的企业更是少之又少；大部分都是在简易的环境或设备中完成保藏工作，很容易引起保藏的菌种不纯，带有杂菌，保存时温度不稳定，致使影响菌种活化时的性状；这些也是导致国内企业虽然有自己的菌种保藏室或保藏环节，但收效甚微，菌种退化现象频出。

(2)在大量制备种包(或保存斜面)的基础上，通过经验观察，从大量的培养物中寻找尚未退化的种包，进行生产，这一方法在国内大部分食用菌企业中应用；其在短时间内效果尚可，且不需要购置额外的实验设备，但随着生产时间的延长，这一方法的有效性逐渐下降，到了后期，可能需要从上百个种包中才能挑出几个没有退化的，劳动力成本巨大，而且没有解决菌种退化。

(3)矿物油保藏法，也称石蜡油保藏法，石蜡可以防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低食用菌代谢活动，使其处于休眠状态，且菌种可以长时间保藏在室温环境中；此方法简单易行，无需特殊设备，成本低，国内企业均可应用。但在实际生产应用该方法使用较少，原因是在活化转接时石蜡油去除不干净，需转接数代，菌丝才能恢复生长，且活性会有一定程度的降低。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种减少菌种保藏后活性下降的食用菌生产菌种保藏方法。本发明还提供一种上述食用菌生产菌种保藏方法获得菌种的活化方法。

为解决上述技术问题，本发明的食用菌生产菌种保藏方法包括以下步骤：

(1)在洗净、干燥的密闭容器内装入混合液(甘油-石蜡油)，所述混合液包括甘油30-50％(v/v)、石蜡油50-70％(v/v)，对所述混合液进行灭菌；灭菌采用高压蒸汽灭菌容器完成所述混合物的灭菌，灭菌条件为121℃灭菌30-40min，或126℃灭菌20-30min，冷却室温后备用。

传统的石蜡油菌种保藏法中，石蜡油(矿物油的一种)的添加可以减少培养基中水分的蒸发而引起菌种死亡，同时可以阻止氧气的进入，减弱菌丝细胞的代谢作用。矿物油是精炼液态烃的混合物，主要为饱和的环烷烃与链烷烃的混合物，有烷烃、芳烃、环烷烃及部分烯烃。虽然矿物油毒性低，但其却被广泛应用于农作物病虫害的防治材料，故，长期接触矿物油会对细胞造成伤害。在长期的菌种保藏过程中，菌丝细胞由于缺水，导致细胞膜的透性增加，矿物油渗入细胞的量也会随之提高，从而导致菌丝活性下降显著，后期需要长期的活化周期。

甘油是微生物的代谢产物，对微生物细胞的活性基本无影响，且在营养贫乏时，细胞可启动甘油代谢，利用其维持自身的基本生理需求；同时，甘油具有保湿性，能自由扩散通过细胞膜，维持细胞内外渗透压平衡，可以减少矿物油进入细胞的数量，降低矿物油对细胞的危害；同时，甘油与石蜡油属性一致，都为有机物，可以替代矿物油在菌种保藏中使用；但是，甘油的水溶性较石蜡油高，随着保藏时间的延长，培养基表面的水份会慢慢蒸发，若将甘油完全替代矿物油，即甘油含量较高，则会明显降低菌包的保藏期，其保藏期与正常的斜面菌种保藏几乎一致。

甘油对微生物基本没影响，石蜡油和矿物油对微生物的生理代谢有影响的，甘油可以由微生物代谢生成，也可以作为碳源被利用，石蜡油和矿物油是种化合物，不能被微生物利用，也无法由微生物代谢生成。

(2)选择菌落无缺角的平板，选取尖端菌丝至营养贫瘠的培养基斜面(培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养，培养长至培养基斜面长度的4/5时，在试管中加入无菌的甘油-石蜡油混合液体覆盖培养基斜面及菌丝，试管塞用蜡烛油封住，常温保存。

采用甘油-石蜡油混合液代替传统的石蜡油，能够有效降低石蜡油对菌丝的毒害作用，有利于减少菌种保藏后活性下降的趋势。

上述食用菌生产菌种保藏方法获得菌种的活化方法，包括以下步骤：

(1)活化培养基配制及灭菌：在固体培养基中加入浓度为10-40％的海藻糖溶液，并对培养基进行灭菌；灭菌采用高压蒸汽灭菌容器灭菌，灭菌条件为1211℃灭菌15-20min。

海藻糖是美国食品药品监督管理局(fda)认证的功能性低聚糖，可以被菌丝细胞吸收利用，其能保持细胞活性和保湿的作用。在食用菌长期保藏前，菌丝能够吸收部分海藻糖，贮存在细胞内；在保藏过程中，菌丝表面长期浸没在矿物油中，即处于失水状态，而胞内的海藻糖可以有效维持细胞的含水量，保持细胞活性。

(2)在酒精灯附近，用灼烧冷却后的接种铲挑取1cm×1cm的菌块，移至新鲜的无菌固体培养基(加入海藻糖溶液的培养基)中培养，待平板菌丝生长稳定后移入种包、生产栽培包，观察其生长性状、出菇情况，无异常现象后可投入生产使用。

保藏菌种活化的培养基，采用10-40％海藻糖溶液配制，对菌丝活性的恢复有显著的提升。

本发明能够在企业现有的生产条件下，无需添置新设备，也无需增加或提高操作工人的专业技能，对生产菌种进行保藏。此方法能在常温下长时间(3-5年，高于常规的3年以下)保藏，而且中途使用也不会对后续的保藏有影响。此方法使用成本低，易于推广，符合现阶段国内食用菌企业的现状。本发明能有效解决原来传统方法的不足之处，能较好地维持菌种原有活性，且又能减轻生产企业制菌包环节的工作量，有效地帮助企业生产。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为传代保藏模式图。

图2为呈“同心圆”菌丝图。

图3为呈“缺角圆”菌丝图。

图4为传统石蜡油保藏法2次传代后平板菌丝生长速率图。

图5为本发明保藏法2次传代后平板菌丝生长速率图。

具体实施方式

实施例

(1)灭菌

①在洗净、干燥的磨口锥形瓶或其他密闭容器内，装入甘油50％(v/v)(30-50％(v/v)内选择均可)，石蜡油50％(v/v)(50-70％(v/v)内选择均可)。

②采用高压蒸汽灭菌容器完成上述混合液的灭菌，灭菌条件为121℃灭菌30-40min，或126℃灭菌20-30min，冷却室温后备用。

(2)菌种保存

①选取不同生产包中的菌丝，用接种铲挑取相同规格大小的正方形菌块(一般为1-2cm×1-2cm)至营养丰富的固体培养基(如添加3-5％酵母粉的马铃薯葡萄糖培养基)培养3-5d，培养温度以培养种包的温度为准，以形成直径为5-6cm的圆形菌落为至，观察菌落的形状，选出菌落圆圈完整、菌丝洁白、浓密的平板。

②用接种铲挑取距离菌丝顶端1cm处的菌丝，移至无菌、营养贫瘠的培养基斜面(如马铃薯葡萄糖琼脂培养基，其中马铃薯煮沸的时间可缩至10-15min)培养，培养温度以培养种包的温度为准，待长至斜面长度的4/5时停止培养(培养基斜面的最长端离试管口的距离在3-5cm)。沿试管壁，往试管中缓慢添加无菌甘油-石蜡油混合液体，直至覆盖琼脂斜面及菌丝；用蜡烛油或石蜡融化后封住试管口。

③普通食用菌品种的试管斜面只需在常温下保存，不需冷却；高温型食用菌斜面，在冬季需移至空调房里(室温＞10℃)，即可。

传代保藏的模式(如图1所示)：

①初始菌种接60支试管是开始完成的，以供一年生产使用。

②试管斜面用甘油-石蜡油混合液体保藏。

③每周初取一支试管转接10个扁瓶，供下周生产使用。

④在转接扁瓶前可根据情况进行取尖端菌丝、纯化、复壮。

⑤使用扁瓶直接转接至原种瓶。

这一传代保藏模式在现有条件下可操作，且所有母种也仅仅是初始菌株的第2或3代。注：a、用于传代的培养基应尽可能成分单一、营养贫瘠，这样可减慢菌丝生长的速度，利于保藏。b、若隔年仍使用这一初始菌株，在转接扁瓶前应进行二至三代的尖端菌丝培养，恢复其活性。c、在生产中要不断纯化菌种，组织分离，寻找合适的生产菌株。d、当菌种传代次数增多，即连续几年使用同一菌株时，应更换不同的保藏培养基，维持其原有的生长能力。

(3)活化培养基配制及灭菌

①选用保藏菌种最适的固体培养基配方，可适当增加氮含量(氮源比例可提高5-10％)，用浓度为20％的海藻糖溶液(浓度可选择10-40％)配制。可制作试管斜面或固体平板培养基，两种形式均可。

②采用高压蒸汽灭菌容器灭菌，灭菌条件为1211℃灭菌15-20min，冷却凝固后备用。

(4)保藏菌种的活化及使用

①在无菌室或接种室中，事先进行消毒，可采用紫外灯照射20-30min；或者在接种前90min开启臭氧发生器，60min后关闭，30min后开始操作；或者用药物喷雾消毒，如2％浓度的煤酚皂、3％的苯酚(石碳酸)、2％的过氧乙酸；或者用药物熏蒸法消毒，一般可用二氧化氯或二氯异氰尿酸钠。

②操作人员的人、镊子、接种铲、试管外壁等均要用75％的酒精棉球擦拭消毒，其中镊子、接种铲使用前用火焰灼烧、冷却后方可使用。

③在酒精灯附近，用灼烧冷却后的接种铲挑取1cm×1cm的菌块(带培养基)，移至新鲜的无菌活化培养基中培养；操作时试管尽量不要垂直放置，以减少环境中微生物坠入试管，引起杂菌污染；挑取菌块时尽量减少带入甘油-石蜡油混合液至固体培养基，同时要避免甘油-石蜡油混合液沾附在试管口附近，形成杂菌生长环境；挑取结束后，仍要用熔化的蜡烛油封住菌种保藏的试管口。

④菌块在固体培养基上培养，以种包培养温度为准，待菌落长至直径为5-7cm的同心圆时，挑取尖端菌丝(距菌丝顶端0.5-1cm)至新鲜固体培养基培养，此操作重复1-2次。

⑤待菌丝生长稳定(生长速率和颜色与正常性状的一致、菌落同心圆的完整性)，挑取5-6块1-2cm×1-2cm的菌块至种包培养，菌丝长满后按照正常转接流程，接至生产栽培包，观察其生长性状、出菇情况，无异常现象后可投入生产使用。

保藏菌种的活化使用：

1、取保藏斜面上的菌块于固体培养基(如马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养基用10-40％的海藻糖溶液配制)培养，不断取尖端菌丝于同种培养基内培养，传代1-2代，使其适应培养环境，并保持最佳活性。

2、选取在传代性状中表现稳定的菌丝做“脱毒”实验(以杏鲍菇为例)：

①取菌丝于营养琼脂培养基上，适宜条件培养，观察有无细菌菌落生成，确保菌丝没有带菌。

②取菌丝于母种培养基，23℃培养至菌丝长到0.5cm，移至37℃培养1h，再转入23℃继续培养，观察菌丝有无变化，确保生产菌株有较强的抗逆能力。

③取菌丝置于母种培养基中，23℃培养，观察其生长轨迹是否呈“同心圆”性状(健康状态，如图2所示)，若呈“缺角圆”的菌落(亚健康状态，如图3所示)则不可作为后期保藏菌种。

对比例

方法与实施例相同，但采用传统的石蜡油进行保藏。

以目前国内成熟的工厂化栽培品种杏鲍菇为例，分别采用实施例的保藏方法和传统的石蜡油保藏法，保藏时间分别为3个月、6个月和1年，检测传代2次的菌丝生长速率。

从图4、5可以看出，采用传统的石蜡油保藏法，菌丝生长速率下降明显，保藏1年后下降了近一半，且随着保藏时间的延长，仍有下降的可能；改良的保藏法，菌丝生长速率有小幅度下降(下降了20％)，且下降趋势较平稳。表明本发明的保藏法有效。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。