快速鉴别培养基及其在纤维素酶定性检测中的应用的制作方法

本发明属于纤维素酶的检测，特别是指快速鉴别培养基及其在纤维素酶定性检测中的应用。

背景技术：

纤维素酶(cellulases)是指在各种酶组分的协同作用下降解纤维素，使之转化为还原糖类的酶，包括外切β-1，4-葡聚糖苷酶(exoβ-1，4-glucanase，ec3.2.1.91)、内切β-1，4-葡聚糖苷酶(endoβ-1，4-glucanase，ec3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase，ec3.2.1.21)。不同来源的纤维素酶中以上三种组分的比例不同。

中华人民共和国轻工业行业标准《纤维素酶制剂》(qb2583-2003)公布了纤维素酶的测定方法：一是滤纸酶活力(fpa)的测定方法；二是羟甲基纤维素(还原糖法)酶活力(cmca-dns)测定方法；三是羟甲基纤维素(粘度法)酶活力(cmca-vis)测定方法。其中前两种是通过测定底物生成的还原糖来反映纤维素酶的总酶活力；而第三种是通过测定底物的粘度与标准酶对照得到纤维素酶的相对酶活力。

酶制剂样品定量检测时对待测样品的酶活力有范围要求，如qb2583-2003中滤纸酶活力的测定方法要求试样与空白液吸光度的差值在0.3-0.4范围内；羟甲基纤维素酶活力测定方法要求吸光度差值在0.33-0.35范围内。在实际生产应用时对一些未知酶活力的样品，需要先评价其是否含有纤维素酶，然后检测样品中纤维素酶活力的具体指标。

目前在酶活力测定时通常将未知的酶制剂样品稀释不同的倍数，然后依据qb2583-2003检测不同稀释倍数样品的具体活力指标，每个稀释倍数的样品要有三个重复。上述方法需要进行大量试剂的配制并进行酶催化反应和比色过程，且某些试剂的保质期较短；同时对于颜色较深的低酶活力的样品无法用比色法检测是否有纤维素酶活力。因此qb2583-2003方法对于定性评价是否含有纤维素酶来说费时、费力，如果有能够快速鉴别样品是否含有纤维素酶的方法，为精确定量测量提供辅助，有利于提高实际生产的效率。

沈萍主编的《微生物学》2000版中提到用平皿透明圈法筛选产酶微生物菌株是微生物筛选工作中比较常用的手段之一。而目前报道的有通过平皿透明圈的方法筛选产纤维素酶菌株的方法，比如黄胜威在《暗黑鳃金龟幼虫肠道微生物分子多态性及纤维素降解菌多样性的研究中》用初筛培养基对菌株产纤维素酶能力进行筛选，将挑选得到的纯培养菌株接种到羟甲基纤维素钠固体培养基平板上，培养的第3天、第5天和第7天时分别取出，进行刚果红染色。测量其分解圈直径(d)和菌落直径(d)，并计算每个菌株的d/d值，根据值的大小确定菌株产酶能力的强弱。申请号为201310004456.0的发明专利申请中公开了一种彩色生物纤维素在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，是利用彩色生物纤维素凝胶在纤维素酶产生菌活性快速检测中的应用，以彩色的生物纤维素凝胶作为底物与纤维素酶产生菌的发酵培养液反应，反应完成后直接观测溶液的颜色，而不使用dns试剂进行显色反应。申请号为201810032356.1的发明专利申请中公开了一种同时筛选蛋白酶和纤维素酶的培养基及方法，采用同时添加蛋白酶底物明胶蛋白和纤维素酶底物羧甲基纤维素的方式，制备培养基：1-3gnano3；0.8-1.2gk2hpo4；0.4-0.6gmgso4；0.4-0.6gkcl；1-3g羧甲基纤维素或微晶纤维素；8-12g明胶；1-3g酵母浸粉；16-18g琼脂或琼脂糖；加水定容至1000ml。结合先碘熏后考马斯亮蓝染色的方法，建立同时检测和筛选纤维素酶和蛋白酶活性菌株的快捷方法。但以上三种方法初衷是鉴别产酶微生物或者发酵液中纤维素酶情况，需要进行长时间的微生物培养或者酶催化反应，同时鉴别培养基成分复杂，对纤维素酶有颜色要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速鉴别培养基及其在纤维素酶定性检测中的应用，能够快速鉴别纤维素酶是否存在，且能够比较不同样品纤维素酶活力的大小，为纤维素酶的精确测量提供参考。

本发明的整体技术构思是：

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠1g/l-10g/l；琼脂5g/l-15g/l；余量为水；ph＝6.0-7.2。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基20ml-30ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液1μl-10μl，置于30℃-50℃条件下培养0.5-1小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色10-30分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗1-15分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗2-5次，直至出现明显边界的透明圈。

本发明的具体技术构思还有：

为测量透明水解圈的直径，以验证其对应的纤维素酶的酶活，优选的技术实现手段是，还包括一步骤d，该步骤的工艺条件如下：

d、对步骤c中出现明显边界的透明圈进行测量。

为步骤b中用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液0：0u；1：20u；2：40u；3：100u；4：200u。

为验证本发明的技术效果，申请人进行了如下试验：

一、与黄胜威方法对比

1、试验材料

1号-产纤维素酶菌株筛选培养基：k2hpo41.9g/l；kh2po40.94g/l；kcl1.6g/l；nacl1.43g/l；nh4cl0.15g/l；mgso4·7h2o0.037g/l；cacl2·2h2o0.017g/l；yeastextract0.1g/l；羟甲基纤维素钠10g/l；琼脂15g/l；ph＝7.2。(参考黄胜威方法)

2号-本发明中的纤维素酶快速鉴别培养基：羟甲基纤维素钠1-10g/l；琼脂5-15g/l；ph＝6.0-7.2。

2、试验器具

无菌培养皿，量筒，直尺，灭菌锅，超净工作台，酶活为10万u/g的纤维素酶，浓度为1mg/ml刚果红染液，浓度为1mol/l的nacl溶液，浓度为0.1mol/l、ph＝6.0的磷酸盐缓冲液。

3、试验方法

(1)纤维素酶检测平皿的制备

将灭菌未凝固的1号、2号两种培养基用量筒分别称量20-30ml倒入培养皿内，凝固后待用。

(2)不同活力纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液0：0u；1：20u；2：40u；3：100u；4：200u，无菌条件下在每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液1-10μl，置于30℃-50℃条件下培养0.5-1小时。

(3)染色及清洗

向培养结束后的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色10-30分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗1-15分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗2-5次，直至出现明显边界的透明圈。

(4)用直尺对不同酶活力水解圈进行测量。

4、试验结果

从图1看出，除对照0点外，不同酶活力的样品均显示出了透明圈，说明本发明中成分简单的2号培养基与黄胜威方法中公开的1号复杂培养基均可以定性检测纤维素酶是否存在。

表1不同酶活力透明圈大小比较

从表1看出不同酶活力样品显示不同直径的透明圈，且酶活力越大，透明圈直径越大。说明利用本发明中的快速鉴别培养基对不同纤维素酶样品进行酶活力大小的比较。另外可以比较酶活力差值在20u的不同纤维素酶样品。

二、本发明中的方法与现有方法相比

表2本发明中定性检测纤维素酶方法与其它方法比较表

相比目前的现有方法，本发明中检测纤维素酶方法具有检测时间短，培养基成份简单，对样品颜色没有要求的优点。可以定性检测液体或固体形态的含纤维素酶样品。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

本发明中检测纤维素酶的方法比报道了检测产纤维素酶菌株或其发酵液的方法比，检测时间短，且培养基成份简单，对样品颜色没有要求。可以定性检测液体或固体形态的含纤维素酶样品。

附图说明

图1是本发明中不同酶活力的透明圈对比示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

实施例1

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠10g/l；琼脂15g/l；余量为水；ph＝7.2。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基30ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液10μl，置于50℃条件下培养1小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色30分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗15分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗5次，直至出现明显边界的透明圈；

d、对步骤c中出现明显边界的透明圈进行测量。

为步骤b中用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液0：0u；1：20u；2：40u；3：100u；4：200u。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠1g/l；琼脂5g/l；余量为水；ph＝6.0。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基20ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液1μl，置于30℃条件下培养0.5小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色10分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗1分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗2次，直至出现明显边界的透明圈。

其余内容同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠5g/l；琼脂10g/l；余量为水；ph＝6.5。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基25ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液5μl，置于40℃条件下培养0.8小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色20分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗8分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗3次，直至出现明显边界的透明圈。

其余内容同实施例1。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠3g/l；琼脂6g/l；余量为水；ph＝6.0-7.2。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基22ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液3μl，置于35℃条件下培养0.6小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色15分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗5分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗3次，直至出现明显边界的透明圈。

其余内容同实施例1。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

快速鉴别培养基，由如下原料组成：

羟甲基纤维素钠9g/l；琼脂12g/l；余量为水；ph＝6.0-7.2。

快速鉴别培养基在纤维素酶定性检测中的应用，包括如下工艺步骤：

a、纤维素酶检测平皿的制备

称量灭菌且未凝固的快速鉴别培养基28ml置于培养皿内凝固；

b、纤维素酶的点样

用磷酸盐缓冲液配制不同酶活力的纤维素酶溶液，无菌条件下在快速鉴别培养基的每个培养皿中加不同酶活力的纤维素酶溶液9μl，置于45℃条件下培养0.9小时；

c、染色及清洗

将步骤b中的培养皿取出后倒入刚果红溶液，染色25分钟，弃去刚果红溶液，加入nacl溶液漂洗12分钟，弃去nacl溶液，重复漂洗4次，直至出现明显边界的透明圈。

其余内容同实施例1。