本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
背景技术：
社区获得性肺炎(communityacquiredpneumonia，cap)是指在院外由细菌、病毒、衣原体和支原体等多种微生物所引起的感染性肺实质(含肺泡壁，即广义上的肺间质)炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎。cap致病原的组成和耐药性在不同国家、地区存在明显差异，且随时间的推移而发生变迁。医院获得性肺炎(hospitalacquiredpneumonia，hap)，亦称医院内肺炎(nosocomicalpneumonia，np)，是指患者入院时不存在、也不处感染潜伏期，而于入院48小时后发生的，由细菌、真菌、支原体、病毒或原虫等病原体引起的各种类型的肺实质炎症。快速、准确地检测下呼吸道感染细菌的种类和含量，对cap和np的临床治疗和指导临床用药具有重要意义。
分离培养法是检测下呼吸道感染细菌的常用方法，其检验结果常被作为呼吸道细菌感染确诊的“金标准”，但是该方法的特异性和敏感性均较差，不适用于感染程度较轻时的早期诊断，无法满足快检测的需求。
血清学检测也是检测下呼吸道感染细菌的常用方法，该方法以人体产生的相关抗原作为检测目标，然而抗原的产生受病程的影响较大，例如，人体感染后早期产生的igm，需要在感染1周后才能被检测到，无法满足快检测的需求；而且，对于婴幼儿来说，由于免疫功能尚未发育完全，产生抗体的能力较差，利用血清学检测有极大的可能出现假阴性，检测结果不够准确。
技术实现要素：
本公开的目的是提供一种特异性和灵敏度高的、快速、准确检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂、试剂盒及系统。
为了实现上述目的，本公开提供一种用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-24所示的引物和seqidno.27-38所示的探针。
可选地，分别由seqidno.1-24所示的引物的含量各自为200-800nmol，分别由seqidno.27-38所示的探针的含量各自为200-300nmol。
可选地，所述核酸试剂还包括内标对照；
所述内标对照含有seqidno.25-26所示的引物和seqidno.39所示的探针，其中，分别由seqidno.25-26所示的引物的含量各自为200-800nmol，由seqidno.39所示的探针的含量为200-300nmol。
可选地，所述核酸试剂包括a管、b管、c管和d管；a管含有seqidno.1-6、25-26所示的引物和seqidno.27-29、39所示的探针；b管含有seqidno.7-12、25-26所示的引物和seqidno.30-32、39所示的探针；c管含有seqidno.13-18、25-26所示的引物和seqidno.33-35、39所示的探针；d管含有seqidno.19-24、25-26所示的引物和seqidno.36-38、39所示的探针。
可选地，seqidno.27、30、33、36所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.28、31、34、37所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.29、32、35、38所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.39所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、vic荧光标记、cy5荧光标记和rox荧光标记中的一种。
可选地，所述下呼吸道感染细菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种。
本公开还提供一种用于检测下呼吸道感染细菌的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、udg酶、dna模板和定量标准品中的至少一种。
本公开还提供上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测下呼吸道感染细菌的试剂盒中的用途。
本公开还提供一种用于检测下呼吸道感染细菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置；所述a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器分别为装载有权利要求4～6中任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道和rox荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若空白对照、阳性对照和内标对照成立，各荧光通道均检测到s形曲线，各靶基因标准曲线与内标基因标准曲线的相关系数均满足︱r︱≥0.98，且相应荧光通道检测到内标基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果有效；
若荧光通道检测到靶基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阳性；
若荧光通道检测到靶基因的浓度小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阴性；
若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎链球菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有流感嗜血杆菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有卡他莫拉菌；
若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有铜绿假单胞菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有鲍曼不动杆菌；
若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有阴沟肠杆菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有洋葱伯克霍尔德菌；若c管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；
若d管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有金黄色葡萄球菌；若d管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有屎肠球菌；若d管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有粪肠球菌；
若同一检测管中，相应荧光通道检测到内标基因的浓度为c1copies/ml，相应荧光通道检测到靶基因的浓度为c2copies/ml，则输出靶基因的浓度值c2与内标基因的浓度值c1的比值a。
可选地，所述处理器还用于实现如下处理过程：
根据内标基因的荧光定量标准曲线和待测样品中所述内标基因的ct值，确定所述待测样品中内标基因的浓度值c1；
根据各靶基因的荧光定量标准曲线和待测样品中所述各靶基因的ct值，分别确定所述待测样品中各靶基因的浓度值c2。
本公开的有益效果在于：
本公开能够快速、准确地实现待测样本中12种下呼吸道感染细菌的检测，避免血清学、病原培养学等方法的繁琐操作，达到如下的检测效果：
(一)较高的多重检测能力
本公开所建立的检测方法，能够通过在4个反应体系中同时筛查与鉴别肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌，快速简便地确认下呼吸道感染细菌的病原种类，节省时间、人力和试剂成本。
(二)灵敏度高
本公开所建立的检测方法能够实现12种下呼吸道感染细菌的同时检测，反应体系中每种目标基因的检测灵敏度均可达到1×104copies/ml，与单重实时荧光pcr检测敏感度相当。
(三)特异性高
本公开所建立的检测方法中，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，不仅能够将检测目标相互区分，而且还能与核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物区别开，这些微生物至少包括人冠状病毒、念珠菌、巨细胞病毒、肠道病毒、麻疹病毒、人偏肺病毒、腺病毒、鼻病毒、百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、无毒结核分枝杆菌、脑膜炎奈瑟菌、化脓链球菌、呼吸道合胞病毒、唾液链球菌、棒状杆菌、乳杆菌、淋球菌、流感病毒、副流感病毒，疱疹病毒等。
(四)线性相关性好
本公开所建立的检测方法检测梯度稀释的样本，线性相关系数r均大于0.98。
(五)预防假阴性结果
本公开所建立的检测方法中，利用内标对照(ic)，可以有效提示假阴性检测结果。
(六)预防假阳性结果
本公开所建立的检测方法体系中含有dutp-ung防污染措施，可以有效提示假阳性结果。
(七)检测结果直观准确
采用内源性基因作为内标基因，其浓度能反映待测样品中的感染细胞浓度，通过靶基因的浓度值与内标基因的浓度值的比值，能够直观反映出受下呼吸道感染细菌感染的程度，避免待测样品中感染细胞浓度不同干扰感染程度的判断。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-24所示的引物和seqidno.27-38所示的探针。
本公开提供的核酸试剂，采用多重荧光pcr技术，能够快速、准确地筛查和鉴别肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌。所述核酸试剂对上述下呼吸道感染细菌检测的特异性好、灵敏度高，可用于感染程度较轻的患者的早期诊断，同时，相较于血清学检测，更加适用于产生抗体能力较差的患者的诊断。
多重荧光pcr技术中，探针与引物的组合效果对扩增效果有重要影响，上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估tm值一致性、gc含量均一化、避免出现发夹结构及引物二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述至少12种下呼吸道感染细菌，特异性良好、覆盖度高并且灵敏度高。
根据本公开，上述核酸试剂中，各引物和/或探针的相对含量可以在较大的范围内变化。例如，分别由seqidno.1-24所示的引物的含量各自为200-800nmol，分别由seqidno.27-38所示的探针的含量各自为200-300nmol。
根据本公开，为控制反应体系的内部质量，更好地判断反应是否受到干扰，排除假阴性结果，所述核酸试剂还可以包括内标对照。进一步地，所述内标对照可以含有seqidno.25-26所示的引物和seqidno.39所示的探针。此时，分别由seqidno.25-26所示的引物的含量各自为200-800nmol，由seqidno.39所示的探针的含量为200-300nmol。所述内标对照一方面可以有效提示因为操作失误、pcr抑制物等原因造成的假阴性检测结果，另一方面还可用于评判样本质量，使检测在同一样品水平下进行，防止样本浓稠度不一致造成下呼吸道感染细菌的定量结果存在较大差异，同时，还可用于确定检测样本中目标菌的相对含量。其中，可以以内源性的beta-actin内标基因为模板设计上述阳性内质控引物和探针。
根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，例如，所述核酸试剂可以包括a管、b管、c管和d管；a管可以含有seqidno.1-6、25-26所示的引物和seqidno.27-29、39所示的探针；b管可以含有seqidno.7-12、25-26所示的引物和seqidno.30-32、39所示的探针；c管可以含有seqidno.13-18、25-26所示的引物和seqidno.33-35、39所示的探针；d管可以含有seqidno.19-24、25-26所示的引物和seqidno.36-38、39所示的探针。
进一步地，为了使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别，可以对探针进行荧光标记的排列组合。例如，作为一种实施方式，seqidno.27、30、33、36所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.28、31、34、37所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.29、32、35、38所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.39所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、vic荧光标记、cy5荧光标记和rox荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，seqidno.27、30、33、36所示的探针具有fam荧光标记；seqidno.28、31、34、37所示的探针具有vic荧光标记；seqidno.29、32、35、38所示的探针具有cy5荧光标记；seqidno.39所示的探针具有rox荧光标记。探针中fam为6-羧基荧光素，vic为购自abi公司的染料，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明。
根据本公开，所述下呼吸道感染细菌可以包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种。优选地，所述肺炎链球菌的靶基因可以为cpsa基因，流感嗜血杆菌的靶基因可以为ompp6基因，卡他莫拉菌的靶基因可以为copb基因，肺炎克雷伯的靶基因可以为khe基因，铜绿假单胞菌的靶基因可以为oprl基因，鲍曼不动杆菌的靶基因可以为blaoxa-51-like基因，阴沟肠杆菌的靶基因可以为ampc酶基因，洋葱伯克霍尔德菌的靶基因可以为reca基因，大肠埃希菌的靶基因可以为ydij基因，金黄色葡萄球菌的靶基因可以为femb基因，屎肠球菌的靶基因可以为ddl基因，粪肠球菌的靶基因可以为esp基因。
本公开的第二方面提供了一种用于检测下呼吸道感染细菌的试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有反应体系缓冲液、udg酶和dna模板和定量标准品中的至少一种。所述定量标准品包括各靶基因定量标准品和内标基因定量标准品，所述定量标准品利用不同浓度的靶基因质粒或者内标基因质粒制备而成，其浓度的标定方法可以领域内的常规方法，在此不再赘述。
本公开的试剂盒能够实现快速、全面、准确、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌同时进行检测并定量的敏感性、特异性和简便性。
本公开的第三方面提供了上述任意一项所述的核酸试剂在制备用于检测下呼吸道感染细菌的试剂盒中的用途。
本公开的第四方面提供了一种用于检测下呼吸道感染细菌的系统，该系统包括具有a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器的pcr仪、计算装置和输出装置；所述a管检测器、b管检测器、c管检测器和d管检测器分别为装载有上述任意一项所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器；所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、vic荧光通道、cy5荧光通道和rox荧光通道中的一种；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：
若空白对照、阳性对照和内标对照成立，各荧光通道均检测到s形曲线，各靶基因标准曲线与内标基因标准曲线的相关系数均满足︱r︱≥0.98，且相应荧光通道检测到内标基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果有效；
若荧光通道检测到靶基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阳性；
若荧光通道检测到靶基因的浓度小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阴性；
若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎链球菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有流感嗜血杆菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有卡他莫拉菌；
若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有铜绿假单胞菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有鲍曼不动杆菌；
若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有阴沟肠杆菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有洋葱伯克霍尔德菌；若c管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；
若d管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有金黄色葡萄球菌；若d管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有屎肠球菌；若d管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有粪肠球菌；
若同一检测管中，相应荧光通道检测到内标基因的浓度为c1copies/ml，相应荧光通道检测到靶基因的浓度为c2copies/ml，则输出靶基因的浓度值c2与内标基因的浓度值c1的比值a。
所述内标基因可以是内源性基因，例如，所述内标基因可以是内源性的beta-actin基因，内标基因的浓度反映了待测样品中的感染细胞浓度，靶基因的浓度值c2与内标基因的浓度值c1的比值a代表了单个感染细胞中的细菌数量，能够直观反映出受下呼吸道感染细菌感染的程度，避免待测样品中感染细胞浓度不同干扰感染程度的判断。
根据本公开，可以采用标准曲线法测定待测样品中靶基因和内标基因的浓度值，此时，所述处理器还用于实现如下处理过程：
根据内标基因的荧光定量标准曲线和待测样品中所述内标基因的ct值，确定所述待测样品中内标基因的浓度值c1；
根据各靶基因的荧光定量标准曲线和待测样品中所述各靶基因的ct值，分别确定所述待测样品中各靶基因的浓度值c2。
优选情况下，在检测过程中，若同一检测管中，相应荧光通道检测到内标对照的浓度不小于1×103copies/ml，且相应荧光通道检测到靶基因的浓度为1×103～2×1010copies/ml，则检测过程正常继续进行；若同一检测管中，相应荧光通道检测到内标对照的浓度不小于1×103copies/ml，但是相应荧光通道检测到靶基因的浓度大于2×1010copies/ml，则稀释本次检测样本后重新检测，直至相应荧光通道检测到靶基因的浓度为1×103～2×1010copies/ml；若相应荧光通道检测到内标对照的浓度小于1×103copies/ml，则更换样品后重新检测。
通过本公开的上述系统，能快速、灵敏、特异地实现肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌的系统筛查，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和试剂成本。
以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。
实施例1检测方法及检测结果判定
1、引物、探针合成
按照表1所示的引物序列和表2所示的探针序列，进行序列合成。探针中fam为6-羧基荧光素，cy5为5h-吲哚菁，rox为6-羧基-x-罗丹明，vic为购自abi公司的染料，bhq1和bhq2为淬灭基团。
表1
表2
2、样本处理
将液化后的痰液样本在13000rpm的转速条件下离心5分钟，离心所得沉淀加生理盐水200μl混匀，继续在13000rpm的转速条件下离心洗涤5分钟，重复两次。离心洗涤结束后，去除上清液，所得沉淀加入50μl核酸提取液和10μl内标对照，震荡混匀，100℃金属浴或沸水浴加热10分钟，然后在13000rpm的转速条件下离心10分钟，取上清液作为pcr扩增模板。
3、构建检测体系
按照如下操作配制反应体系：总体系20μl，具体配置如下：pcr反应液(含udg酶)15μl；10×引物探针混合物2μl(每条引物的浓度为3-6μm，每条探针的浓度为1-3um)，dna模板5μl。
试剂盒分为a管、b管、c管和d管4个反应管，a管含有上表1中seqidno.1-6、25-26所示的引物和上表2中seqidno.27-29、39所示的探针；b管含有上表1中seqidno.7-12、25-26所示的引物和上表2中seqidno.30-32、39所示的探针；c管含有上表1中seqidno.13-18、25-26所示的引物和上表2中seqidno.33-35、39所示的探针；d管含有上表1中seqidno.19-24、25-26所示的引物和上表2中seqidno.36-38、39所示的探针。
将pcr管放入荧光定量pcr仪中，选择fam、vic、cy5、rox作为报告基团，反应程序如下：
a：50℃，2min；
b：95℃，5min；
c：95℃，15s，
d：55℃，45s；c-d循环40个反应，该阶段收集荧光。
检测结果判定：
若空白对照、阳性对照和内标对照成立，各荧光通道均检测到s形曲线，各靶基因标准曲线与内标基因标准曲线的相关系数均满足︱r︱≥0.98，且相应荧光通道检测到内标基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果有效；
若荧光通道检测到靶基因的浓度不小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阳性；
若荧光通道检测到靶基因的浓度小于1×103copies/ml，则判定检测结果为阴性；
若a管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎链球菌；若a管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有流感嗜血杆菌；若a管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有卡他莫拉菌；
若b管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有铜绿假单胞菌；若b管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有肺炎克雷伯菌；若b管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有鲍曼不动杆菌；
若c管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有阴沟肠杆菌；若c管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有洋葱伯克霍尔德菌；若c管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有大肠埃希菌；
若d管第一荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有金黄色葡萄球菌；若d管第二荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有屎肠球菌；若d管第三荧光通道的检测结果为阳性，则判定样品中含有粪肠球菌；
若同一检测管中，相应荧光通道检测到内标基因的浓度为c1copies/ml，相应荧光通道检测到靶基因的浓度为c2copies/ml，则输出靶基因的浓度值c2与内标基因的浓度值c1的比值a。
实施例2最低检出限验证
评估用检测样本：使用商品化的试剂盒分别提取肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的基因组dna，并定量浓度为1×106copies/ml，然后分别进行梯度稀释得到浓度为1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml的评估用模板。
按照实施例1的检测方法分别对各浓度的评估用模板进行检测，每个浓度梯度重复检测20次，取均值作为最后的检测结果，如表3所示。
表3
注：“+”代表阳性，n/20代表检出率为20次重复n次检出
由表3可以看出，本公开试剂盒检测目标细菌种属基因的最低检出限浓度均达到1×103copies/ml，本公开试剂盒检测灵敏度较高。
实施例3特异性验证
选择人冠状病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2233)、巨细胞病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为303)、肠道病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为977)、麻疹病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为1513)、人偏肺病毒(源自中国人民解放军总医院，编号为1768)、鼻病毒(购自中国科学院武汉病毒所，编号为2343)、无毒结核分枝杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为93009)、脑膜炎奈瑟菌(源自中国人民解放军总医院，编号为21123)、化脓链球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为25341)、唾液链球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为25346)、棒状杆菌(源自中国人民解放军总医院，编号为32451)、乳杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为34106)、淋球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为13251)、白色念珠菌、腺病毒、百日咳杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒等与检测目标下呼吸道感染细菌核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状、采样部位正常寄生或易并发的微生物作为特异性评估样本。
应用本公开提供的试剂盒，按照实施例1的检测方法检测上述特异性评估样本，在阴性对照、阳性对照和阳性内对照均成立的条件下，待检目标均未出现非特异性的荧光信号，表明本公开的试剂盒能有效区分非检测目标细菌，具有较好的特异性。
实施例4试剂盒的保存期试验
分别以靶基因浓度为105copies/ml的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的混合模板作为评估用检测样本，在第0天时，分装成9份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、30、90、150、240、300、330、360和390天的试剂盒进行保存期试验。
结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为390天。
实施例5内标检测效果一致性的验证
评估用检测样本：使用鉴定为含有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌的痰液作为评估用样本。
以a反应管为例，调整肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及内标的引物及探针浓度，使内标的扩增效率达到一定的水平。将此扩增效率作为标准，调整b、c和d反应管的引物及探针浓度，从而使四个反应管中内标的扩增效率一致以确保对同一样本检测结果的准确性。具体的，根据单重引物灵敏度的结果，分别选择300nm、400nm、900nm及300nm作为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及内标的引物浓度，200nm作为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌及内标的探针浓度，多重体系混合后，内标定量标准品相关系数︱r︱＜0.9800，不符合定量标准。因此将流感嗜血杆菌的引物浓度降至600nm后再进行多重混合优化，结果为内标定量标准品相关系数︱r︱＞0.9800，且内标对照通道扩增曲线为s型，符合定量标准。b、c和d的优化同a反应管的优化。
实施例6线性相关度验证
评估用检测样本：使用肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌作为评估用待检目标病原菌，调整每种待检目标病原菌悬液的浓度为108cfu/ml，并提取基因组dna，并将提取到的基因组dna稀释成相当于相应病原菌悬液浓度为107cfu/ml，106cfu/ml，105cfu/ml，104cfu/ml，103cfu/ml的评估用检测样本。
应用本公开提供的试剂盒，按照实施例1的检测方法检测上述线性相关度评估用检测样本，并绘制标准曲线，计算各标准曲线的线性相关度，如表4所示。
表4
由表4可以看出，利用本公开所建立的检测方法检测梯度稀释的样本，线性相关系数︱r︱＞0.98，线性相关度较好。
对比例
1、引物、探针合成
按照表5和表6所示的引物、探针序列，进行序列合成。
表5
表6
2、最低检出限验证
按照实施例2的方法进行最低检出限验证。实施例1与对比例的最低检出限对比如下表7。
表7
注：“+”代表阳性，n/20代表检出率为20次重复n次检出
由表7可知，对于样本中痕量的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌的基因组dna，对比例中的引物和探针在检测目标菌的基因组dna浓度为103copies/ml的水平下，流感嗜血杆菌检出率为70％，鲍曼不动杆菌检出率为80％，洋葱伯克霍尔德菌检出率为85％，屎肠球菌检出率为75％，粪肠球菌检出率为50％，本公开试剂盒在检测目标菌的基因组dna浓度为103copies/ml的水平下12个目标检出率均为100％，因此本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。
3、特异性验证
按照实施例3的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的对唾液链球菌(源自中国人民解放军总医院，编号为25346)有非特异性的扩增。说明本公开试剂盒相较于对比例具有更好的检测特异性。
由实施例和对比例可以看出，本公开可以一次性定量检测出肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌和粪肠球菌等12种下呼吸道感染细菌，而且最低检出限较低，灵敏度高，特异性高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，例如a管检测目标和b管检测目标的可以互换。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
中日友好医院
<120>用于检测下呼吸道感染细菌的核酸试剂、试剂盒及系统
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