一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法。

背景技术：

铁是真核生物和原核生物必需的微量营养素。铁在诸如氨基酸的合成，三羧酸(tca)循环活动，dna复制，细胞呼吸和电子传递等代谢过程起重要作用。铁是地球上最丰富的化学元素之一，但是由于它在生理条件下的不溶性以及能形成羟基氧化铁沉淀物，导致溶液中游离的生物可利用的铁极其有限(10^-8-10^-9m)，远低于支持微生物生长的范围(～10^-6m)。细菌为了利用铁来维持自身生长并完成各种生理功能，进化出了一系列能够螯合、摄取铁的系统。嗜铁素介导的铁元素摄入是微生物获取铁元素的最普遍方式。

嗜铁素是一种对三价铁离子具有高亲和力的小分子化合物，其通过螯合宿主细胞或者生长环境中的铁来满足自身生长需求。嗜铁素制剂的使用，既可避免大量使用杀虫剂和杀菌剂，减少病原菌和害虫产生抗药性及化学试剂难降解对环境的危害。

目前，嗜铁素的合成大都是通过筛选高产嗜铁素的菌株，优化菌株发酵的培养基。但菌株是缺乏高效生产的，这使得嗜铁素的产量的提高有限。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法。本发明构建的荧光假单胞菌能够显著提高嗜铁素的产量，且该嗜铁素对于常见的致病菌株金黄色葡萄球菌和李斯特菌以及腐败菌株波罗的海希瓦氏菌均具有拮抗作用，该菌株能够用于食品保鲜和安全控制。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取荧光假单胞菌pf08的基因组dna，以提取的基因组dna为模板，以ggdef-f和ggdef-r为引物，进行pcr扩增ggdef基因；

(2)pcr电泳产物经回收后，与经hindⅲ和bamhⅰ双酶切的载体pbbr1mcs-2连接，获得重组质粒，重组质粒再转化至e.coliwm3064感受态细胞，筛选得到阳性转化子；

(3)利用接合转移将阳性转化子内的重组质粒转化至荧光假单胞菌pf08，经筛选及验证，得到高产嗜铁素的荧光假单胞菌。

根据本发明的一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法，本发明将环二鸟苷酸(c-di-gmp)合成的基因克隆至荧光假单胞菌pf08中，通过过表达c-di-gmp从而有效提高基因工程荧光假单胞菌中嗜铁素的含量，可以实现嗜铁素的高产，在基因工程荧光假单胞菌种嗜铁素的含量达到87.2％。本发明提供的菌株产生的嗜铁素用于抑制病原菌和腐败菌的生长，从而起到降低病原菌对抗菌素产生抗药性的可能，避免有毒有害化学试剂对环境的危害；为食品保鲜和安全控制的产业化应用奠定了基础。

另外，根据本发明上述实施例提出的一株高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述引物ggdef-f和ggdef-r的序列如下：

ggdef-f：5’-cgctctagaactagtggatccatgattatcttacgcaaaggacc-3’；

ggdef-r：5’-gtcgacggtatcgataagcttaattttatacttggcgatagacgacgcg-3’。

根据本发明的实施例，所述荧光假单胞菌pf08保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号：cctccm2020065，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2019年07月17日。

根据本发明的实施例，所述荧光假单胞菌pf08在kmb液体培养液中培养24h后测得嗜铁素活性单位su＝72.69％，as/ar＝0.27，产嗜铁素的能力++++。

根据本发明的实施例，所述荧光假单胞菌pf08产生的嗜铁素类型为异羟肟酸型嗜铁素。

根据本发明的实施例，所述荧光假单胞菌pf08产生的嗜铁素对金黄色葡萄球菌和李斯特菌以及波罗的海希瓦氏菌具有拮抗作用。

根据本发明的实施例，所述步骤(3)中，阳性转化子与荧光假单胞菌pf08的数量比为1:100，接合转移的时间为3h。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明的荧光假单胞菌的菌株在cas平板上的菌落形态；

图2为本发明的野生型pf08菌株和c-di-gmp过表达的pf08菌株产嗜铁素的含量。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，培养基包括：

lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠5.0g，ph7.0。固体培养基另加入20g/l琼脂。

kmb培养基(g/l)：酪蛋白氨基酸5.0g，磷酸氢二钾2.5g，七水硫酸镁2.5g，甘油15.0ml。固体培养基则向其中加入20g/l琼脂。

cas固体培养基：1.5ml1mmfecl3与7.5ml2mmcas均匀后，边搅拌边缓慢加入50ml8mmhdtma溶液，然后加入30ml1mmpepes缓冲液，搅拌均匀后加入11ml蒸馏水，同时向其中加入20g/l琼脂。按照每皿25ml的量倾注于培养皿(直径90mm)中。待凝固后用打孔器在该板上打孔，孔的直径为8毫米。

其中，试剂包括：

arnow实验用于检测儿茶酚型嗜铁素，所用试剂为钼酸盐溶液(g/l)：nano2100g，namoo4100g，将两者混合，用去离子水定容至1l；1ml的1mol/lnaoh溶液；1ml的0.5mol/lhcl。

高氯酸铁实验用于检测异羟肟酸型嗜铁素：量取1.6mlhclo4，称取270.5mg氯化铁，溶于198.4ml超纯水中，得到的混合物避光保存。

fecl3实验用来检测羧酸盐型嗜铁素：0.1mmolfecl3，1mmol盐酸溶于100ml蒸馏水中。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、荧光假单胞菌pf08的筛选：

将实验室保存的从腐败的金枪鱼中筛选得到的八株荧光假单胞菌分别接种到lb液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养3d，得第一发酵液。

按照每孔100μl的量将第一发酵液倾注于cas平板，放置于30℃条件下，培养3d，观察cas平板上菌株的颜色变化。

选取cas平板上变色圈大的菌株作为初筛菌株，接种到lb培养基中，30℃、200rpm培养24h得到种子液。按1％的体积分数接种种子液至20mlkmb液体培养基中，30℃、200rpm下培养24h，得第二发酵液。

然后，均匀取5ml第二发酵液于4℃、10000rpm下离心15min，取3ml上清液与等体积cas溶液混合，在室温下将混合液暗处理1h后在波长630nm处测定od值，通过su(％)＝((ar-as)/ar)×100％，计算出嗜铁素产量。通过as/ar来估计产嗜铁素的能力，as/ar从1.0-0之间以0.2为间隔，每减小0.2增加一个“+”，一般产嗜铁素能力较高(+++)的细菌其as/ar低于0.5，即as/ar越小产嗜铁素能力越强。(其中ar代表等体积的kmb液体培养液与cas溶液混合，于室温下暗处理1h后，在630nm处测得的od值，as代表等体积的菌株发酵液上清液与cas溶液混合，于室温下暗处理1h后，在630nm处测得的od值)。

将八株荧光假单胞菌接种于cas平板上，菌株产生的嗜铁素会夺取蓝色平板中的铁离子，形成黄色晕圈，产生的嗜铁素越多则黄色晕圈的直径越大。结合图1，菌株pf08产生的黄色晕圈最大。将八株荧光假单胞菌接种于液体kmb培养基中，30℃，200rpm，培养24h后离心，上清液与等体积cas溶液混合，其中菌株pf08的as＝od630＝0.080，对照ar＝od630＝0.296。嗜铁素活性单位最大，su＝72.69％，产生嗜铁素的能力as/ar＝0.27，++++，菌株pf08能够产生较高水平的嗜铁素。

经鉴定，该荧光假单胞菌菌株特征如下：是金枪鱼中的优势腐败菌，能够产生较高水平的嗜铁素。

发明人已将本菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号：cctccm2020065，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2019年07月17日，分类命名为pseudomonasfluorescenspf08。

2、鉴定菌株pf08产生嗜铁素的类型：

(1)1ml菌株pf08发酵液上清与arnow试剂混合后为无色透明溶液，说明上清液中无儿茶酚型嗜铁素的存在。

(2)1ml菌株pf08发酵上清液与200μl的100mmol/lfecl3混合后出现橘黄色，说明上清液中含有异羟肟酸型嗜铁素。

(3)1ml菌株发酵上清液与1ml250μmcuso4和2mlph4.0醋酸盐缓冲液混合后，添加1ml水至体积为5ml，混合后进行全波长扫描，在220nm没有出现最大吸收峰，说明不产生羧酸型嗜铁素。

综合上述结果，判断菌株pf08能够合成分泌异羟肟酸型嗜铁素。

3、嗜铁素对病原菌、腐败菌的抑制作用

将菌株pf08发酵液离心过滤，制备嗜铁素粗提液。分别将致病菌金黄色葡萄球菌、李斯特菌和波罗的海希瓦氏菌涂布于相应培养基上，利用牛津杯方法，测定嗜铁素制剂对致病菌的抑制作用。在金黄色葡萄球菌和李斯特菌的平板上形成的抑制圈大且透明，抑菌圈直径分别为16.6mm和15.4mm。在波罗的海希瓦氏菌平板上，嗜铁素形成的抑制菌更明显，抑菌圈直径达到17mm。

嗜铁素通过螯合环境中的铁元素，使致病菌、腐败菌缺乏铁元素，而生长缓慢或停滞，从而达到对致病、腐败微生物的控制目的。本发明提供的菌株产生的嗜铁素用于抑制病原菌和腐败菌的生长，从而起到降低病原菌对抗菌素产生抗药性的可能，避免有毒有害化学试剂对环境的危害；为食品保鲜和安全控制的产业化应用奠定了基础。

实施例2

高产嗜铁素的荧光假单胞菌的构建，步骤如下：

1、提取荧光假单胞菌pf08的基因组dna。

收集过夜培养的菌液pf081ml于1.5ml离心管中室温下8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。菌体采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒进行基因组dna的提取：菌体加入180μlbufferdigestion，再加入20μlproteinasek溶液，振荡混匀；56℃水浴锅中温育60min使菌体充分降解；加入200μlbufferbd混匀；加入200μl的无水乙醇；将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮液全部加入吸附柱中，静置2min，再12000rpm室温下离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放入收集管中，加入500μlpwsolution，10000rpm离心30s倒掉滤液，加入500μlwashsolution，10000rpm离心30s倒掉滤液。将吸附柱放入收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的washsolution。取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μlcebuffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna溶液。

2、以提取的基因组dna为模板，以ggdef-f和ggdef-r为引物，进行pcr扩增ggdef基因，扩增产物长度为1251bp。所述引物ggdef-f和ggdef-r的序列如下：ggdef-f：5’-cgctctagaactagtggatccatgattatcttacgcaaaggacc-3’；ggdef-r：5’-gtcgacggtatcgataagcttaattttatacttggcgatagacgacgcg-3’。

pcr反应总体积为50μl：包括模版dna1μl，上下游引物2μl，2×phantamaxbuffer25μl，dntpmix1μl，phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase1μl，ddh2o182μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸45s；共30个循环；最后延伸72℃5min。扩增产物利用1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并命名为c，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(离心柱型)回收pcr扩增产物。在紫外灯下迅速从凝胶上切下相应的目的条带ggdef，使凝胶块充分溶解，分离出所需要的dna溶液。

3、构建重组质粒并转化到e.coliwm3064感受态细胞。利用限制性内切酶hindiii和bamhi对pbbr1mcs-2质粒进行双酶切。将酶切产物经1.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带(回收步骤同步骤2)。回收后的线性pbbr1mcs-2质粒和步骤2回收的扩增的目的片段进行重组。

重组反应总体系为20μl：包括线性化载体3μl，插入片段1μl，5×ceiibuffer4μl，exnaseii2μl，ddh2o10μl。使用移液枪轻轻吹打混匀后，短暂离心，将反应液收集至管底，37℃反应30min后，立即置于冰上冷却5min。然后，取10μl重组产物加入到100μle.coliwm3064感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。接着42℃水浴热激45s，即刻置于冰上冷却2min，加入900μl不含抗生素的lb培养基，220rpm摇床37℃振荡培养1h。5000rpm离心5min，弃掉900μl上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂布于含有50μl/ml的卡那霉素的lb平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

4、阳性转化子的pcr鉴定。在超净台中挑选步骤3中lb平板上的若干个单菌落，置于ep管中，向其中加入lb液体培养基，摇床37℃振荡培养3h，做菌液pcr反应，反应完成后对pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析筛选出阳性克隆，命名为pbbr1mcs-2-c。

5、利用接合转移将步骤4的阳性转化子内的重组质粒转化至荧光假单胞菌pf08，经筛选及验证，得到高产嗜铁素的荧光假单胞菌。经步骤4pcr验证成功的wm3064与菌体pf08以1:100数量比转接摇3h，其中wm3064的培养基中需添加50μg/ml2,6-二氨基庚二酸(dap)及50μg/mlkan(kanamycin)抗生素。

分别取2ml菌体wm3064及1ml菌体pf08于5000rpm离心2min，并用lb肉汤清洗菌体wm3064两到三次，以除去抗生素。用100μllb肉汤重悬菌体wm3064和菌体pf08。将混合物滴于平板(lb琼脂+终浓度50μg/ml的dap)上晾干后于30℃培养6-10h。将共培养后的菌体洗于1mllb肉汤中，并用lb肉汤清洗2-3次，以除去dap，最后用1mllb肉汤重悬菌体，并以每200μl涂板(lb琼脂+终浓度50μg/mlkan)，30℃培养24h。将上述单菌落挑至cfc假单胞菌选择性平板进行验证(cfc+终浓度50μg/mlkan)，选择单菌落活化储存备用，并命名为过表达pbbr1mcs-2-ggdef：pf08。

实施例3

将第二信使c-di-gmp过表达的pf08菌株(即实施例2构建的pbbr1mcs-2-ggdef：pf08菌株)和野生型pf08菌株按1％体积分数分别接种于lb和kmb培养液中，30℃、200rpm下培养24h。将培养液于4℃、10000rpm下离心15min，取3ml上清液于等体积cas溶液混合，在室温下将混合物暗处理1h后在波长630nm出测od值，通过su(％)＝((ar-as)/ar)×100％，计算出嗜铁素产量。

结果如图2所示，野生型pf08菌株中嗜铁素的含量为72.69％，而c-di-gmp过表达的pf08菌株中嗜铁素的含量为87.2％。不论是在铁富足情况下的lb培养液中还是铁缺乏情况下的kmb培养液中，第二信使c-di-gmp都对嗜铁素的合成均有促进作用，菌体pf08通过第二信使c-di-gmp来调控嗜铁素的合成，通过过表达第二信使c-di-gmp合成蛋白来探究第二信使c-di-gmp对嗜铁素合成的调控作用。

综上，本发明将环二鸟苷酸(c-di-gmp)合成的基因克隆至荧光假单胞菌pf08中，通过过表达c-di-gmp从而有效提高基因工程荧光假单胞菌中嗜铁素的含量，可以实现嗜铁素的高产，在基因工程荧光假单胞菌种嗜铁素的含量达到87.2％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。