多重PCR检测鱼类结节病病原菌的方法与流程

本发明涉及基因检测领域，更具体地，涉及多重pcr检测鱼类结节病病原菌的方法。

背景技术：

鱼类结节病是水产养殖中的常见多发疾病，以内脏出现白色结节为主要症状，组织病理诊断为肉芽肿。该病病程长，传染速度快，死亡率高达100％，夏秋季节为发病高峰期，水温在25～27℃时易发病。主要危害乌鳢(ophiocephalusargus)、大黄鱼(larimichthyscrocea)、鲈(lateolabraxjaponicus)、卵形鲳鲹(trachinotusovatus)等20多种经济鱼类。该病在我国内地以及东南沿海地区经常暴发，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

流行病学调查显示，虽然都会出现肉芽肿的类似临床症状，但结节病的病原呈现多样化，即异菌同症。据报道，越冬罗非鱼会流行一种病因不明的爆发性疾病，常引起大批死亡，临床表现为缺氧状，濒死鱼眼球突出或混浊发白，腹部膨胀,鳃丝水肿。解剖观察,腹腔有腹水,脾、肝、肾肿大,有白色结节状病灶，实验鉴定其病原为嗜水气单胞菌。随后，研究人员相继从患结节病的卵形鲳鲹、革胡子鲶和加州鲈中相继分离出鰤鱼诺卡氏菌，其症状也都表现为肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变。近年来，研究人员又先后从患内脏结节病的卵形鲳鲹、五条鰤和条石鲷中分离出美人鱼发光杆菌杀鱼亚种。此外，舒氏气单胞菌，星状诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌也可能会导致鱼类发生结节病。

由于结节病从发生到死亡的延续时间长且早期体表无明显的症状,给预防和治疗带来较大的困难，研究早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。目前针对某个结节病病原菌的检测已有一些研究，然而由于结节病病原较多，现有的检测方法成本较高且通量小，本项目拟通过多重pcr检测方法，在同一反应管中实现对六种结节病病原菌的同时检测，以便在发病早期即可确定是哪种病原菌导致的结节病，从而制定有针对性的防控策略，减少养殖过程的损失。

病原菌的检测经历了从传统培养法、免疫学检测方法和分子生物学检测的发展历程。但是目前的检测方法尚不能完全令人满意，仍存在改进空间。

技术实现要素：

为弥补现有技术的不足，解决现有技术中病原菌检测周期长、一次性检测种类少的问题，本发明提供了一种同时检测六种鱼类结节病病原菌的引物组和方法。可以同时检测嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌。针对以上病原菌的特性，设计了六对特异性引物，利用普通的pcr仪即可完成检测。通过琼脂糖电泳即可判断是哪种病原菌导致鱼体产生了结节病。整个过程操作简单，特异性强，检测成本低。

本发明提供了一种pcr检测鱼类结节病病原菌的方法，包括：

提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组dna；

对病原菌的基因组dna进行引物设计，引物如下：

嗜水气单胞菌上游引物，核苷酸序列如sedidno.1所示，

嗜水气单胞菌下游引物，核苷酸序列如sedidno.2所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，核苷酸序列如sedidno.3所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，核苷酸序列如sedidno.4所示，

星状诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如sedidno.5所示，

星状诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如sedidno.6所示，

舒氏气单胞菌上游引物，核苷酸序列如sedidno.7所示，

舒氏气单胞菌下游引物，核苷酸序列如sedidno.8所示，

鰤鱼诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如sedidno.9所示，

鰤鱼诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如sedidno.10所示，

杀鲑诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如sedidno.11所示，

杀鲑诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如sedidno.12所示；

利用上述引物和pcr方法同时对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组dna进行扩增和检测。

在上述方法中，其中，上述引物分别以嗜水气单胞菌的hlya、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16srrna、星状诺卡氏菌的16s-23srrna、舒氏气单胞菌的gyrb、鰤鱼诺卡氏菌的16s-23srrna、杀鲑诺卡氏菌的16s-23srrna为靶基因而设计。

在上述方法中，其中，所述pcr方法的反应体系为：

2×taqpcrmix25μl，

10μmol/l嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μl，

10μmol/l美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μl，

10μmol/l星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，

10μmol/l舒氏气单胞菌上下游引物0.5μl,

10μmol/l鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，

10μmol/l杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，

质粒模板0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl。

在上述方法中，其中，所述pcr方法的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1.同时快速鉴定多个结节病病原菌

本发明建立的多重pcr方法可以同时检测嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌六种结节病病原菌，相对于现有技术所建立的方法，增加了检测的通量，只需一步实验即可确定是哪种病原菌引起的结节病，有利于及时制定有针对性的防控策略，同时具有节省人力成本和时间成本的优势。

2.特异性和灵敏度高

本发明的多重pcr检测引物组具备高度特异性，所有引物都经过primerblast比对分析，都具有高度的保守性和特异性；同时能够在混合模板或模拟样品中，仅目的片段产生扩增，证明该检测方法具有高度的特异性。本发明所建立的检测方法能够实现六种病原菌的同时检测，最低检出限可达100pg/μl，为养殖的临床检测中对上述6种结节病病原菌的检测提供一种准确快速、经济有效的手段，对结节病的早期防控具有重要意义。

附图说明

图1为引物的特异性分析电泳图，模板为6种病原菌的基因组dna:m：marker2000bp；n：阴性对照，模板为无菌双蒸水；1:嗜水气单胞菌；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌；5：鰤鱼诺卡氏菌；6：杀鲑诺卡氏菌。

图2为多重pcr检测6种结节病病原菌的电泳图：1:嗜水气单胞菌；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌；5：鰤鱼诺卡氏菌；6：杀鲑诺卡氏菌；7:2×rtaqpcrmix扩增的6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，星状诺卡氏菌，舒氏气单胞菌，鰤鱼诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌)；8:2×extaqpcrmix扩增的6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，星状诺卡氏菌，舒氏气单胞菌，鰤鱼诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌)；m:marker2000bp。

图3为混合质粒模板的多重pcr灵敏度电泳图：m：marker2000bp；1:1000ng/μl；2:100ng/μl；3:10ng/μl；4:1ng/μl；5:100pg/μl；6:10pg/μl；7:1pg/μl；8:100fg/μl；9:10fg/μl。

图4为模拟样品的检测电泳图：1:杀鲑诺卡氏菌；2:美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和鰤鱼诺卡氏菌；3:舒氏气单胞菌；4:星状诺卡氏菌；5:嗜水气单胞菌；m:marker2000bp。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供了一种同时检测六种结节病病原菌的多重pcr检测用的引物组和方法，具体方案如下：

提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组dna。

引物的设计与筛选，所述引物如下：

嗜水气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.1所示，

嗜水气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.2所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，其核苷酸序列如sedidno.3所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，其核苷酸序列如sedidno.4所示，

星状诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.5所示，

星状诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.6所示，

舒氏气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.7所示，

舒氏气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.8所示，

鰤鱼诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.9所示，

鰤鱼诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.10所示，

杀鲑诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.11所示，

杀鲑诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.12所示。

所述引物为分别以嗜水气单胞菌的hlya，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16srrna，星状诺卡氏菌的16s-23srrna，舒氏气单胞菌的gyrb，鰤鱼诺卡氏菌的16s-23srrna，杀鲑诺卡氏菌的16s-23srrna为靶基因而设计的6对引物。

利用上述引物扩增嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的全基因组dna，将pcr产物进行胶回收，连接t载体后，转化至dh5α感受态细胞，挑取单克隆送至上海生工测序，将测序正确的菌液扩大培养，利用omega质粒提取试剂盒提取相应的重组质粒。

建立一种多重pcr的检测方法，分别以上述重组质粒作为模板，利用所设计的引物进行多重pcr扩增，并对反应条件进行优化，得到最佳反应条件。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中所述的引物筛选方法为：利用所设计的引物进行扩增，筛选最佳引物组合如下。

嗜水气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.1所示，

嗜水气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.2所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，其核苷酸序列如sedidno.3所示，

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，其核苷酸序列如sedidno.4所示，

星状诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.5所示，

星状诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.6所示，

舒氏气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.7所示，

舒氏气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.8所示，

鰤鱼诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.9所示，

鰤鱼诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.10所示，

杀鲑诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如sedidno.11所示，

杀鲑诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如sedidno.12所示。

多重pcr的反应体系如下：2×taqpcrmix25μl，10μmol/l嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μl，10μmol/l星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l舒氏气单胞菌上下游引物0.5μl,10μmol/l鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，质粒模板0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl；

扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。

多重pcr检测结节病病原菌的引物组，包括嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌上下游引物共6对引物对，分别是序列表sedidno.1和2、sedidno.3和4、sedidno.5和6、sedidno.7和8、sedidno.9和10、sedidno.11和12的碱基序列；所述6对引物对分别扩增嗜水气单胞菌的hlya，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16srrna，星状诺卡氏菌的16s-23srrna，舒氏气单胞菌的gyrb，鰤鱼诺卡氏菌的16s-23srrna，杀鲑诺卡氏菌的16s-23srrna；所述6对引物对的浓度比为1:1:1:1:1:1。

多重pcr检测结节病病原菌的方法，其采用6对引物对目标基因的重组质粒进行扩增，电泳检测扩增的目的条带大小分别为：1409bp,988bp,520bp,350bp,250bp,150bp。

根据多重pcr检测结节病病原菌中的六种病原菌的方法，所述pcr扩增的反应体系为：包括：2×rtaqpcrmix或2×extaqpcrmix25μl，10μmol/l嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μl，10μmol/l星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l舒氏气单胞菌上下游引物0.5μl,10μmol/l鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl；

扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。

一、材料与方法

1.材料

1.1样本

嗜水气单胞菌、星状诺卡氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，舒氏气单胞菌购自广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)。

1.2试剂

细菌基因组dna提取试剂盒购自天根公司，pcrmix，marker2000，pmd18-t载体购自takara公司，胶回收试剂盒购自thermo公司，dh5α感受态细胞购自北京全式金，质粒提取试剂盒购自omega公司，引物由上海生工生物合成。

2.方法

2.1引物设计

从genbank上下载六种结节病病原菌的多条基因序列进行比对，设计引物，引物序列见序列表。

2.2单一引物的特异性实验

1)dna提取：采用细菌基因组dna提取试剂盒提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的dna，然后置于-20℃保存；

2)pcr反应：取上述dna样品，进行pcr反应。其中pcr反应的体系为：2×taqpcrmix25μl，10μmol/l的上下游引物均为1μl，模板0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl；

3)pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min；

4)电泳检测：取5μlpcr产物，利用1％琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为200ma、120v，电泳时间为25min，电泳完成后，放入凝胶成像系统中进行拍照；

5)检测结果分析：将电泳带与阴性对照进行对比，判定被检样品中是否含有嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌；如果检测样品在1409bp,988bp,520bp,350bp,250bp,150bp出现相应的条带，则判为阳性，否则为阴性。

实验结果参见图1，其中m：marker2000bp；n：阴性对照，模板为无菌双蒸水；1:嗜水气单胞菌阳性；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种阳性；3：星状诺卡氏菌阳性；4：舒氏气单胞菌阳性；5：鰤鱼诺卡氏菌阳性；6：杀鲑诺卡氏菌阳性。

结果表明，引物特异性良好，在混合模板下，只有相应的靶基因产生扩增。

2.3多重pcr方法的建立

与2.2不同之处在于：pcr反应的模板还包括6种含有结节病病原菌靶基因的重组质粒混合物。

pcr反应：取上述质粒dna1:1混合，进行pcr反应。其中pcr反应的体系为：包括：2×rtaqpcrmix或2×extaqpcrmix25μl，10μmol/l嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μl，10μmol/l美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μl，10μmol/l舒氏气单胞菌上下游引物0.5μl，质粒模板0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl；

1)扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。

2)实验结果参见图2，其中1:嗜水气单胞菌阳性；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种阳性；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌阳性；5：鰤鱼诺卡氏菌阳性；6：杀鲑诺卡氏菌阳性；7：6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌)；8：6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌)；m:marker2000bp。

结果表明，所用引物不仅特异性良好，而且相互之间无交叉反应。此外，利用2×extaqpcrmix的扩增效果更好。

2.4灵敏度分析

将含有靶基因的重组质粒稀释至1000ng/μl,然后1:1混匀后，将混合物进行10倍梯度稀释后进行多重pcr检测，pcr反应的体系和条件如2.3。

实验结果参见图3，m：marker2000bp；1:1000ng/μl；2:100ng/μl；3:10ng/μl；4:1ng/μl；5:100pg/μl；6:10pg/μl；7:1pg/μl；8:100fg/μl；9:10fg/μl。

结果表明，本发明所用的引物组及检测方法，嗜水气单胞菌的最低检出限为10fg/μl；美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的最低检出限为10fg/μl；星状诺卡氏菌的最低检出限为10fg/μl；舒氏气单胞菌的最低检出限为100pg/μl；鰤鱼诺卡氏菌的最低检出限为100fg/μl；杀鲑诺卡氏菌的最低检出限为1pg/μl；6种病原菌的最低检出限为100pg/μl。

2.5模拟样品的检测

取培养过夜的嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌菌液与乌鳢的脾脏组织混合均匀，制备模拟样品，提取dna后按照2.3的反应条件进行pcr扩增，结果显示本发明的引物组和检测方法可以正确的检出杀鲑诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和鰤鱼诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、星状诺卡氏菌和嗜水气单胞菌。

序列如下所示：

sedidno.1：caccgcactcagacca

sedidno.2：tgcaatccgaacagg

sedidno.3：gagtcgctagtaatcgcag

sedidno.4：ctgtgcagttctcaaacaac

sedidno.5：ctagtaatcgcagatcagca

sedidno.6：ttactaacaaagatgctcgc

sedidno.7：agtggaacgacgcctat

sedidno.8：ttgttgaccacgattttg

sedidno.9：ctgcaactcgacctcgt

sedidno.10：tcgaagagtttgcgtaga

sedidno.11：atggtgtcggctcagtc

sedidno.12：ccgaaatcatgttccaa

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110>广东海洋大学深圳研究院；深圳义海生物科技有限公司

<120>多重pcr检测鱼类结节病病原菌的方法

<130>hp191211lz

<141>2019-11-21

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

caccgcactcagacca16

<210>2

<211>15

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

tgcaatccgaacagg15

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

gagtcgctagtaatcgcag19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

ctgtgcagttctcaaacaac20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

ctagtaatcgcagatcagca20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

ttactaacaaagatgctcgc20

<210>7

<211>17

<212>dna

<213>人工序列()

<400>7

agtggaacgacgcctat17

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>8

ttgttgaccacgattttg18

<210>9

<211>17

<212>dna

<213>人工序列()

<400>9

ctgcaactcgacctcgt17

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>10

tcgaagagtttgcgtaga18

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列()

<400>11

atggtgtcggctcagtc17

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>人工序列()

<400>12

ccgaaatcatgttccaa17