水稻稻瘟病基础抗性基因pi21-2428的功能分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及一种水稻稻瘟病基础抗性基因pi21-2428的分子标记及其应用，属于农作物分子遗传育种学领域。

背景技术：

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，有大约一半的人口以大米为主食。稻瘟病由稻瘟菌引起，是影响水稻最严重的病害之一，每年可造成10-30%的稻米损失（dean等，2005）。在与稻瘟菌共进化的过程中，水稻进化出不同层次的抗病机制来防御稻瘟菌的侵害。生产实践结果表明，利用这些抗病基因资源，培育抗病品种是防治稻瘟危害最经济、最有效的手段。

截至到目前为止，全世界已鉴定了100多个主效抗稻瘟病基因和qtl位点（srivastava等，2017），并至少有23个主效基因被克隆出来（liu等，2014）。主效抗病基因的鉴定和克隆促进了水稻抗稻瘟病分子育种工作的发展。但另一方面，主效抗病基因虽然效应好，但存在小种特异性，容易因生理小种变化，丧失抗病性。水稻还存在基础抗性，其抗性效应中等，但不存在小种特异性，抗谱广，是培育持久抗病品种的理想基因资源。因此，挖掘基础抗性基因资源并建立其相应的分子标记体系已经成为科学家和水稻育种工作者的重要工作。

本发明在长期开展水稻种质资源筛选的过程中，鉴定到水稻品种02428具有对稻瘟病菌的广谱抗性。进一步研究发现，02428携带一个新型稻瘟病基础抗性基因pi21单倍型（pi21-02428）。基于上述基础，本发明建立了pi21-02428的功能分子标记体系，其对选育具有良好基础抗性水稻新品种具有积极的意义。

技术实现要素：

本发明目的在于为水稻育种工作者提供一种水稻抗稻瘟病基因pi21-2428的分子标记及其应用。利用引物组合p21-f/p21-r检测与水稻稻瘟病基因紧密连锁的分子标记，精确筛选出携带有稻瘟病基因的水稻植株，从而大大缩短水稻抗稻瘟病新品种的培育时间，简化培育过程。

本发明利用qtl-seq技术，在水稻品种02428中鉴定到4个qtls，通过生物信息学手段，鉴定到一个pi21的有功能的新单倍型，pi21是早期鉴定的有名的隐性基础抗性基因，本次发现的单倍型存在两段缺失，分别是30bp和33bp。

基于上述发现，本发明通过引物组合p21-f/p21-r经pcr扩增获得一种水稻抗稻瘟病基因的分子标记，编号id21-2428。

本发明所述的水稻抗稻瘟病基因分子标记的引物组合p21-f/p21-r序列如下：

p21-f:5′-caaggctaatcagcagtgt-3′；

p21-r:5′-ttggcgttgtcctcggtgt-3′。

本发明还提供了水稻抗稻瘟病基因pi21-2428的检测方法，包括以下步骤：

1）对待检测水稻材料样品的基因组dna进行提取；

2）利用所述引物组合p21-f/p21-r对其基因组dna进行pcr扩增获得一条729bp的条带，则证明所述抗稻瘟病基因存在与该水稻材料之中。

本发明同时提供了一种培育抗稻瘟病水稻品种的方法，步骤是：

1）把含有所述抗稻瘟病基因的水稻品种02428或其衍生材料作为亲本，与其他选定的水稻材料进行杂交或回交获得后代群体；

2）利用所述引物组合p21-f/p21-r对上述所获得的后代群体进行pcr扩增和检测，筛选能检测到该分子标记所扩增的729bp的分子标记条带，则说明该植株携带有抗稻瘟病基因。

本发明的优点及有益效果：

1）本发明基于分子遗传学、植物病理学和生物信息学等研究手段，发现了水稻品种02428存在隐性基础抗性基因pi21的新单倍型，并发明了相应的分子标记id21-2428，利用该分子标记可以高效地鉴定和筛选携带有所述基因的水稻品种所配置杂交群体中含有该基因的单株，显著提高抗稻瘟病水稻品种的培育效率。常规育种方法成本高、周期长、干扰因素多且精确度差，分子标记辅助育种则在很大程度上弥补了上述缺点，加快了培育优良品种的进程。

2）本发明所提供的分子标记特异性强，能够准确区分抗稻瘟病品种02428杂交后代群体中的纯合型和杂合型单株，快速获得所需的具有纯合该基因型的抗稻瘟病植株，选择效率达到100%。

因此，运用本发明所建立的水稻抗稻瘟病分子标记体系，能够高效、精准地鉴定和筛选出水稻育种群体中纯合目标基因的植株，大大缩短抗稻瘟病水稻新品种培育过程。

附图说明

图1为水稻品种02428和lxg接种稻瘟菌501-3、guy11和rb22后的发病对比图。

图2为02428×lxg的f2分离群体对稻瘟菌rb22的抗感病分级统计柱状图。

图3为为水稻品种02428×lxg的f2群体抗/感稻瘟病极端分离池全基因组snp平均等位频率分析结果。

图4为鉴定到的四个qtl位点的置信区间可视化。

图5为59株极端抗病株和61株极端感病株的pi21基因型分析柱状图，存在三种不同的基因型：pi21-02428纯和基因型、pi21-lxg纯和基因型和pi21-02428/pi21-lxg杂合型。

图6为分子标记检测02428×lxg的f2分离群体部分极端抗/感病单株的电泳图谱，其中，m：分子量marker；p1：lxg；p2：02428；1-6为02428×lxg的f2分离群体中的极端抗病单株；7-12为02428×lxg的f2分离群体中的极端感病单株。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。下述实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。

实施例1水稻品种02428稻瘟病抗性性状的遗传分析

在早期的研究过程中，本发明人发现水稻品种02428对稻瘟菌具有很好的基础抗性，为了进一步验证02428的抗性，以立新粳（lxg）（林世成,闵绍楷.中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:154;345）为感病对照，接种稻瘟菌501-3（guox,zhongd,xiew,hey,zhengy,liny,chenz,hany,tiand,liuw,wangf,wangz,chens.functionalidentificationofnovelcelldeath-inducingeffectorproteinsfrommagnaportheoryzae.rice.201912(1):59.doi:10.1186/s12284-019-0312-z）、guy11和rb22。结果表明，02428对501-3、guy11表现为中等感病，对rb22表现为中等抗性；lxg对三种稻瘟菌均表现为极端感病，这表明02428对稻瘟菌具有很好的基础抗性（图1）。

为了更准确的验证该结论，利用水稻品种02428与lxg配制f2遗传群体，以稻瘟菌株rb22接种f2群体。对626个f2单株进行稻瘟病抗性级别调查调查，统计结果显示f2代群体对rb22的抗性呈正态分布，说明02428对稻瘟菌rb22抗性为基础抗性。

实施例2bsa-seq技术鉴定02428稻瘟病基础抗性基因位点

基于上述02428×lxg的f2代遗传分离群体接种稻瘟菌rb22的实验结果，在接种池中挑选126株极端抗病株、120株极端感病株以及15株亲本02428植株和15株亲本lxg植株，分别混合成池，提取dna，利用二代高通量测序技术对这4个dna池进行测序，并进行分离池snp频率计算和连锁分析，结果显示，存在4个显著性位点，分别命名为qbbr-4，qbbr-7，qbbr-8和qbbr-11，分别位于第4号染色体、第7号染色体、第8号染色体和第11号染色体（图2）。进一步查询水稻基因组信息，发现qbbr-4与一个已知的抗病基因pi21共定位（图3），因此我们进行对02428序列进行测序分析，结果发现pi21-2428为一个新型的单倍型，其与普通非抗病基因型比，缺失了两段30bp和33bp的序列（图4）。

实施例3分子标记验证

将pi21-02428基因型的两段缺失序列开发成分子标记，并设计引物组合p21-f/p21-r，其对应的pi21-02428基因型扩增片段为729bp，其对应的pi21-lxg基因型为765bp。序列如下，划线部分为引物：

pi21-2428序列:

atgggtatattggtcatcttggtggacctgcaatgctgccgctgcgatgccaagatcaggaaggtcctgggctgccttgaaggtataataaattctgcccgaatcgtccatgtttgattgaattttcaaggctaatcagcagtgttcctgctcaattgggagcaaaacctctgttaaaaagggtgtgtttgaatgaatataattgaatatgaacgcagaggagtactgcatcgagaaggtggagtacgacgtgaagaacaacagggtgatcgtgcgcgggaagttcgacccggagaagctgtgcaagaagatctggtgcaaggccggcaagatcatcaaggagatcctcatcgtcgacgtctggccgccgccgccgccgtgcgagaagcctccggaggactgcaagcccaagccctgccattgctgcagctgcgagaagcccaagcccaagcccaagccctgccactgcgagaagcccaagccctgtcactgcgagaagcccaagccatgcgagaagccgccgccggagaagccgccgccgaagccggagtgcaagctggtgccgtacccttacccggtgccgtacccgtacgccgggcagtggtgctgcccaaagcctgagccgccgaagccgccgccggagccaccgaaggagccggagccgccgaagccgtgcgggtgctcgcacgccttcgtgtgcgtctgcaagccggcgccgccgccgccgccgccgtgcgggtgctcggggggccacgggaactgcggctgcggcatcaggccgtggccgccgcaggtgtggccgccgccgcccgtctgcccgccgccgccgtggtgctacaccgaggacaacgccaacgcctgctccatcatgtga。

pi21-lxg序列：

atgggtatattggtcatcttggtggacctgcaatgctgccgctgcgatgccaagatcaggaaggtcctgggctgccttgaaggtataataaattctgcccgaatcgtccatgtttgattgaattttcaaggctaatcagcagtgttcctgctcaattgggagcaaaacctctgttaaaaagggtgtgtttgaatgaatataattgaatatgaacgcagaggagtactgcatcgagaaggtggagtacgacgtgaagaacaacagggtgatcgtgcgcgggaagttcgacccggagaagctgtgcaagaagatctggtgcaaggccggcaagatcatcaaggagatcctcatcgtcgacgtctggccgccgccgctgccgcagccgccgccgccgtgcaagccgccgccgtgcgagaagcctccggaggactgcaagcccaagccctgccattgctgcagctgcgagaagcccaagcccaagcccaagccctgccactgcgagaagcccaagccctgtcactgcgagaagcccaagccatgcgagaagccgccgccgtgcaagccggaggagccgccgaagccggagtgcaagctggtgccgtacccttacccggtgccgtacccgtacgccgggcagtggtgctgcccaaagcctgagccgccgaagccgccgccggagccaccgaaggagccggagccgccgaagccgtgcgggtgctcgcacgccttcgtgtgcgtctgcaagccggcgccgccgccgccgccgccgtgcgggtgctcggggggccacgggaactgcggctgcggcatcaggccgtggccgccgcaggtgtggccgccgccgcccgtctgcccgccgccgccgtggtgctacaccgaggacaacgccaacgcctgctccatcatgtga。

为了进一步证明所述分子标记的可靠性，选择稻瘟菌rb22接种02428×lxg的f2群体，并挑选极端抗病单株59株和极端感病单株61株，分别提取单株dna，利用引物组合p21-f/p21-r检测pi21基因型；统计结果显示pi21-02428纯和基因型共22株，全部表现为极端抗病；pi21-lxg纯和基因型共52株，其中有11株为极端抗病，41株为极端感病；pi21-lxg/pi21-02428杂合为46株，其中有28株为极端抗病，18株为极端感病（图5）；部分单株的电泳图谱见图6，其中729bp条带为pi21-2428基因型。结果发现，携带有pi21-02428基因型的植株具有稻瘟病基础抗性。表明所述分子标记的选择效率达到100%。

sequencelisting

<110>闽江学院

<120>水稻稻瘟病基础抗性基因pi21-2428的功能分子标记及其应用

<130>4

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