巴斯德毕赤酵母菌菌株KM71及用途的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种巴斯德毕赤酵母菌(pichiapastoris)菌株km71及用途。

背景技术：

抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharidefactor，alf)是一种脂多糖结合蛋白，是甲壳动物体内广泛存在的一类抗菌肽，最早是从美洲鲎的阿米巴血细胞中分离鉴定的，在同一物种的甲壳动物体内可以克隆到很多片段大小、碱基序列都不相同的alf基因。甲壳动物的先天性免疫防御系统，能够发现进入体内的有害外源微生物并能及时消灭它们，保护机体不被伤害，具有特别强的防御能力，在此过程中，抗菌肽作为重要的免疫效应因子，通过结合脂多糖，调节细胞脱颗粒作用，引起一系列级联反应，从而能够有效地清除病原微生物，在体液免疫中发挥重要作用。因此，在甲壳动物体内克隆到形态与功能多样性的抗脂多糖因子能够起到增强机体的免疫防御能力的作用。

基于alf具有良好的抑菌活性，且由于其直接中和细菌细胞壁的脂多糖，溶解细菌，与传统抗生素的作用机理不同，因此在动物体内既不会产生残留也不会出现耐药性，有望替代传统的抗生素治疗作为控制疾病、提高免疫力和控制水质的有效新途径。抗脂多糖因子参与生产出的抗菌产品不论是在水产养殖业还是医学领域都有着非常可观的发展前景。

目前，在中国明对虾中已克隆获得7种形式的alf因子(fcalf1、fcalf2、fcalf3、fcalf4、fcalf5、fcalf6、fcalfc)(郭书悦等，中国明对虾抗脂多糖因子的多态性及其功能活性研究[d].青岛：中科院海洋研究所，2014.)上述文献中仅披露了上述7个基因的主要功能区对应的多肽，更重要的是其合成的多肽alf4功能区仅对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌具有抑制作用，不能抑制革兰氏阴性菌鳗弧菌和革兰氏阳性菌藤黄微球菌和溶壁微球菌，说明其合成的多肽alf4功能区抑菌谱狭窄，抑菌效果差。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种巴斯德毕赤酵母菌(pichiapastoris)菌株km71及用途，所述的菌株、发酵液或其产物抗脂多糖多肽抑菌谱广泛，可抑制革兰氏阴性致病菌和革兰氏阳性致病菌如对鳗弧菌、副溶血性弧菌、爱德华氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌均具有明显的抑制作用，且抗菌活性显著，可以用于制备水产动物养殖的饲料添加剂进行病害防治、提高水产动物免疫力及改善养殖水体的微生态制剂。

为此，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种巴斯德毕赤酵母菌(pichiapastoris)菌株km71，于2017年9年5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14575。

本发明提供了一种抑菌剂，包括上述的菌株、上述的菌株发酵液或上述的菌株的产物抗脂多糖多肽；所述抗脂多糖多肽具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种饲料添加剂，包括上述的菌株、上述的菌株发酵液或上述的菌株的产物抗脂多糖多肽；所述抗脂多糖多肽具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种饲料组合物，包括上述的菌株、上述的菌株发酵液或上述的菌株的产物抗脂多糖多肽以及生理上可接受的赋形剂或稀释剂；所述抗脂多糖多肽具有如seqidno.1所示的氨基酸序列。

所述的饲料组合物，所述饲料组合物包括上述的菌株的发酵液15-25体积份、对虾饲料100重量份和海藻酸钠5-15重量份；所述饲料组合物中所述菌株终浓度为3～6×10⁷cfu/g；所述重量份和体积份的比值关系为g/ml。

本发明提供了如下a1-a3在抑菌中的用途，所述a1-a3为：

a1、上述的菌株；

a2、上述的抑菌剂；和/或

a3、上述的饲料添加剂。

在所述的用途中，所述抑菌包括抑制革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；

在所述的用途中，所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌；所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌或爱德华氏菌。

在所述的用途中，包括制备抑制对虾副溶血性弧菌感染制剂的用途。

在所述的用途中，包括制备提高对虾免疫力、体长或体重制剂的用途。

优选的，包括制备提高半滑舌鳎免疫力或生存率的制剂或饲料的用途；更优选的，包括制备提高半滑舌鳎对腹水病的抵抗能力的制剂或饲料的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种巴斯德毕赤酵母菌(pichiapastoris)菌株km71，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14575，上述菌株可以高表达抗脂多糖多肽，因此上述菌株的发酵液同样具有显著的抑菌作用，体外抑菌试验表明，其对大肠杆菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌均具有明显的抑制作用，说明本发明的所述菌株、发酵液或其产物抗脂多糖多肽抑菌谱广泛，可抑制革兰氏阴性致病菌和革兰氏阳性致病菌，且抑菌效果显著，可以用于制备水产动物养殖的饲料添加剂进行病害防治、提高水产动物免疫力及改善养殖水体的微生态制剂，且同时具有安全高效、无残留、无耐药性和无毒副作用的特点，可替代饲用抗生素。

2.本发明提供的饲料添加剂，包括所述的巴斯德毕赤酵母菌(pichiapastoris)菌株km71、发酵液或其产物抗脂多糖多肽，不仅能够促进小对虾快速生长，而且能够提供生长期小对虾自身的免疫力：试验结果显示，喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液的饲料的对虾的多酚氧化酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶sod、过氧化氢酶及溶菌酶活力等特异及非特异免疫酶活相对于对照组对虾均有不同程度的提高，从酶活的水平证明了喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾的免疫力明显提高，大大降低了其死亡率，安全性高、原料来源广、价格低廉，最重要的是，饲料的配置相较于购买成品饲料来说，更加绿色安全，且成本低；

在保证对虾生长的同时，可显著提高对虾的存活率、增重率：试验结果显示，喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾的体重与对照组相比较显著增加，饲喂本发明的凡纳滨对虾饲料的实验组比对照组体重提高了11.23％，表明本发明的凡纳滨对虾饲料对提高对虾体重的增加量具有一定的促进作用；

此外，在提高对虾抗病力方面有显著效果。在用致病性副溶血性弧菌肌肉注射感染对虾的实验中发现，饲喂本发明的饲料添加剂的实验组对虾存活率显著高于对照组，提高了28.71％±6.31％，实验结果说明饲料中添加pichiapastoriskm71菌株发酵液对提高对虾对病原菌副溶血性弧菌的抵抗能力明显增强。

以本发明的饲料添加剂饲喂对虾，可以起到抑制养殖水体中病原弧菌的繁殖，促进对虾生长，提高对虾相关免疫酶活，进而提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。

进一步的，以本发明的饲料添加剂饲喂患腹水病的半滑舌鳎病鱼，发现本发明的饲料添加剂对患腹水病的半滑舌鳎病鱼具有免疫保护作用，半滑舌鳎对腹水病的抵抗能力明显增强，对半滑舌鳎的免疫保护。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中重组质粒pmd18-t-fcalf的pcr检测电泳图，其中m为marker，4、5、6为pmd18-t-fcalf4的pcr产物，“阴”为以pmd18-t空载体为模板的阴性对照pcr结果；

图2是本发明实施例1中为ppic9k-fcalf4的pcr检测电泳图，其中m为marker，1、2、3为ecori-noti双酶切ppic9k-fcalf4重组质粒；

图3是本发明实施例2中重组菌株ppic9k-fcalf4的pcr检测电泳图，其中m为marker，1、2、3为阳性转化子，“阳”为ppic9k-fcalf4载体阳性对照；

图4是本发明实施例2中g418ypd平板筛选高拷贝转化子筛选结果图；

图5是本发明实施例2中为pichiapastoriskm71菌落形态图；

图6是本发明实施例3中不同时间发酵液抑菌活性检测(所用指示菌为大肠杆菌)；

图7是本发明实施例3中sds-page检测结果图；

图8是本发明实施例4中抑菌性检测结果图；

图9是本发明实施例6中为对虾免疫指标的测定结果图，其中(a)为超氧化物歧化酶的测定；(b)为多酚氧化酶活力的测定；(c)为过氧化氢酶活力的测定；(d)为过氧化物酶活力的测定；(e)为溶菌酶活力的测定；(f)为酸性磷酸酶活力的测定；

图10是本发明实施例6中对虾体长及体重增加率的测定，其中(a)为体长增加率的测定，(b)为体重增加率的测定；

图11是本发明实施例6中为副溶血性弧菌感染后对虾死亡率的测定结果图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

lb固体培养基购自生工生物工程有限公司；

pmd18-t载体购自大连宝生物公司；

大肠杆菌dh5α感受态细胞购自生工生物工程有限公司；

毕赤酵母km71由中国海洋大学提供；

md平板配方及制备方法：15g琼脂溶解到800ml水，121℃灭菌15min，冷却至60℃后添加100ml10×ynb，100ml10×d(20％葡萄糖溶液)，2ml500×b(0.02％生物素)，混匀后倒平板。

ypd平板配方及制备方法：配制含10g/l酵母提取物，20g/l葡萄糖，20g/l蛋白胨的水溶液混合物，115℃灭菌15min。

bmgy培养基配方及制备方法：10g酵母提取物，20g蛋白胨溶解到700ml水中121℃灭菌15min，冷却至室温后加入100ml1m磷酸钾缓冲液，100ml10×ynb，100ml10×gy(10％甘油)，2ml500×b；

bmmy培养基配方及制备方法：10g酵母提取物，20g蛋白胨溶解到700ml水中121℃灭菌15min，冷却至室温后加入100ml1m磷酸钾缓冲液，100ml10×ynb，100ml10×m(5％甲醇)，2ml500×b(0.02％生物素)

对虾饲料为粤海牌对虾饲料，由天津市汉沽区对虾养殖基地提供；

半滑舌鳎饲料由天津市海发珍品实业发展有限公司提供；

凡纳滨对虾购自天津市汉沽区对虾养殖基地；

患腹水病的半滑舌鳎病鱼由天津市海发珍品实业发展有限公司提供；_

对虾抗凝剂配方如下表5：

表5对虾抗凝剂配方

按照上述表5的配方配制，用浓盐酸调ph至7.45，即得对虾抗凝剂。

中国明对虾由天津市水产研究所渤海水产资源增殖站提供。

实施例1重组表达质粒ppic9k-fcalf4的构建

(1)引物设计：根据seqidno.2所示的核苷酸序列设计

编码抗脂多糖多肽如seqidno.1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno.2所示，seqidno.2所示序列中5’端和3’端分别具有起始密码子(atg)和终止密码子(tga)。根据seqidno.2所示的核苷酸序列(fcalf4基因)设计引物，设计的上下游引物5’端分别引入酶切位点noti和ecori，下游引物设计了6×his标签，以便于后期重组蛋白的纯化(引物由北京金唯智科技股份有限公司合成)，引物序列如下或如seqidno.3-4所示:

fcalf4-f：gcgaattccaaggcgtgcaggacc；

fcalf4-r：aaggaaaaaagcggccgctcaatgatgatgatgatgatggtgttcaagccaaatc；

(2)中国明对虾cdna的获得

①中国明对虾的rna提取

1)从对虾腹部血窦抽取血淋巴，并加入等体积对虾抗凝剂。血淋巴在4℃，800g离心10min；

2)去上清，收集血细胞,加入1000μltrizal，远远过量(trizal，4℃保存)。4℃，12000g条件下离心10min(目的是离心出多余的蛋白质、脂肪和多糖等)；

3)取上清，静置5min，使其完全裂解；

4)加氯仿(常温下保存，rna专用)，比例为1mltrizal：200μl氯仿；

5)加入200μl氯仿后剧烈震荡15秒(手动)，在室温下静置2-3min；

6)在4℃、12000g条件下离心15min，离心后产生三层，上层(无色水相)为rna，中层(絮状物)为dna，下层(浅红色，酚氯仿相)为蛋白质等；

7)取少量上清(宁少勿多，避免吸入dna)，加500μl异丙醇(rna：异戊醇＝1：1)，轻轻慢慢混匀，静置15min，以便沉淀rna；

8)在4℃、1200g条件下离心10min，弃上清倒置控干；

9)加入75％的乙醇1ml，用枪头轻柔吸打，使rna漂浮起来；

10)在4℃、7500g条件下离心6min，弃上清，放于滤纸上倒置控干大约15min，ep管侧壁的乙醇一般用剪刀剪成的小条吸干；

11)加入适量的depc水溶解(沉淀多的用20μldepc，少的用15μldepc)，若为纯rna会立即溶解；

12)在55℃水浴5min，取出后，先放在冰上保存，用于后续点样、pcr扩增cdna等，后置于-80℃冰箱中保存；

②中国明对虾cdna的合成

以2μg中国明对虾的总rna为反转录模板，上游引物为接头引物bda，下游引物为aolp，引物序列：bda-aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg；aolp-ggccacgcgtcgactagtac(t)16(a/c/g)

1)rna变性

打开pcr仪预热20min，同时在冰上按照表1依次添加试剂，70℃保温5min后冰上迅速冷却2min以上以去除dna变性rna。

表1rna变性所用试剂

2)反转录cdna

按表2体系，将试剂依次添加至1体系中，然后42℃反应2h；70℃保温15min后，冰上冷却。

表2rt-pcr所用试剂

综上，设置pcr仪的反应程序为37℃，30min；70℃，5min；42℃，2h；70℃，15min；4℃，10min。冰上2min，所得cdna于-20℃保存。

(3)克隆fcalf4基因

以上述步骤获得的中国明对虾cdna为模板，按以下表3的pcr扩增体系，将试剂依次添加至200μl的ep管中混匀，按照如下扩增程序进行扩增：94℃预变性4min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；4℃保温5min。

表3pcr扩增体系

(4)fcalf4基因连接pmd18-t载体

将步骤(3)中获得的pcr产物经电泳胶回收后与pmd18-t载体进行连接(按生工pmd18-t载体说明书进行)，16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化后涂布于lb-amp100固体培养基上，37℃培养过夜，以fcalf4-f及fcalf4-r为引物，采用pcr法对长出的转化子进行检测，检测结果如图1所示，将pcr检测阳性的克隆进行测序，获得pmd18-t-fcalf4。

(5)构建重组表达质粒ppic9k-fcalf4

以ecori和noti双酶切步骤(4)中的pmd18-t-fcalf4质粒，回收目的基因，然后与ecori和noti双酶切的ppic9k载体进行t4dna连接酶于16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化后涂布于lb-amp¹⁰⁰固体培养基上，37℃培养过夜，以5’aox1和3’aox1为引物，采用pcr法对长出的转化子进行验证，检测结果如图2所示，将pcr检测阳性的克隆进行测序，从而获得重组表达质粒ppic9k-fcalf4。

实施例2重组菌株ppic9k-fcalf4菌株的构建

(1)重组表达质粒ppic9k-fcalf4转化至毕赤酵母km71

用saci单酶切实施例1制备的重组质粒ppic9k-fcalf4进行线性化处理，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物后用dna胶回收试剂盒(由大连宝生物公司提供)纯化酶切产物。

(2)转化酵母感受态细胞

将步骤(1)纯化的酶切产物转化酵母感受态细胞。首先制备毕赤酵母km71的感受态细胞，采用电击转化法将线性化的重组质粒ppic9k-fcalf4(步骤(1)纯化的酶切产物)转入所述毕赤酵母km71感受态细胞中，涂布在md平板上，直至长出单克隆，然后采用引物5’aox、3’aox进行pcr检测阳性转化子，检测结果如同3所示，将筛选出的阳性转化子，分别点到不同浓度g418ypd平板上，筛选出高拷贝酵母转化子，筛选结果如图4所示，具体方法参考invitrogen公司的说明书进行(multi-copypichiaexpressionkit,versionf)，将获得的高拷贝转化子命名为pichiapastoriskm71。

将筛选的高拷贝转化子进行形态鉴定，结果如同5所示，菌株的形态特征：菌落呈乳白色，菌落湿润黏稠，表面光滑，边缘整齐，隆起程度较高，正反面颜色一致。将上述pichiapastoriskm71，于2017年9年5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14575。

实施例3抗脂多糖多肽(rfcalf4)的诱导表达及纯化检测

(1)抗脂多糖多肽(rfcalf4)的诱导表达

挑取实施例2中获得的重组菌株pichiapastoriskm71的单克隆到100mlbmgy培养基中，30℃培养，培养至od600＝2-6，离心收集细胞，将沉淀细胞重悬在100mlbmmy培养基中，继续培养，每24h添加100μl100％甲醇诱导，在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h取样，检测诱导产物的抑菌活性，确定最佳诱导时间，检测结果如图6所示，由图可知，甲醇诱导84小时时重组抗脂多糖多肽rfcalf4抑菌圈最大，表明其表达量最大。

(2)抗脂多糖多肽(rfcalf4)的纯化检测

将pichiapastoriskm71按照上述(1)中最佳诱导时间为84小时的诱导表达方法制备的发酵液，并取样进行发酵液活性的检测与蛋白含量的测定。用capturem^tmhis-taggedpurificationminiprepkit(宝生物)纯化蛋白后用sds-page检测纯化后的蛋白，电泳结束后用考马斯亮蓝染色液染色3h，用kcl脱色液脱色，直至背景清晰为止，检测结果如图7，纯化后有效去除了杂蛋白，重组抗脂多糖多肽rfcalf4大小接近17kda，纯化的重组抗脂多糖多肽rfcalf4经测序，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

实施例4抑菌性检测

取实施例3中(2)中的发酵液的上清进行抑菌活性分析，包括如下步骤：

将指示菌大肠杆菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于lb液体培养基中，37℃恒温摇床16～18h；将活化后的指示菌用分光光度计测定其od600的值，当od值在0.6～0.8之间浓度为宜；

取指示菌悬液150μl均匀涂布于lb固体培养基中，用无菌的镊子夹取无菌滤纸片置于待检测的发酵液上清中浸透，放置在上述lb固体培养基的培养皿的相应位置，37℃恒温培养24h，观察记录拮抗斑的产生情况，结果显示重组菌株pichiapastoriskm71的发酵液上清液抑菌圈明显清晰，抑菌效果图如图8，图中a：金黄色葡萄球菌b：大肠杆菌c：鳗弧菌d：副溶血性弧菌e：爱德华氏菌f：哈维氏弧菌，对6种常见病原菌大肠杆菌、鳗弧菌、副溶血性弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌的生长均有明显的抑制作用。

实施例5饲料添加剂

本实施例提供了一种饲料添加剂，将活化的重组菌株pichiapastoriskm71接种到含有bmgy培养基的发酵罐中，30℃培养，培养至od600＝2-6，离心收集细胞，将沉淀细胞重悬在含有bmmy培养基的发酵罐中，继续培养，每24h添加100μl100％甲醇诱导，诱导84小时，得到重组菌株pichiapastoriskm71的发酵液，发酵液中重组菌pichiapastoriskm71的终浓度为3～5×10⁸cfu/ml，即为饲料添加剂。

实施例6饲料添加剂对对虾的免疫保护作用

(1)饲料添加剂添加及对虾的饲喂管理

实验组：将实施例5制备的饲料添加剂与对虾饲料充分混合，其中每100g对虾饲料中添加10g海藻酸钠，添加pichiapastoriskm71菌株发酵液20ml，经过调配，使得上述混合物中重组菌pichiapastoriskm71的终浓度为3～6×10⁷cfu/g；

空白对照组：为不添加发酵液的同样对虾饲料。

饲喂方法：选用同一养殖车间的2个养殖池，分别投放2000尾初始体重约3.9g体长约5.3cm的凡纳滨对虾。按凡纳滨对虾体重的5wt％投放饲料，每天投喂4次。观察养殖池中水的变化并及时进行换水，防止水过于浑浊或残留饲料变质导致对虾生长缓慢或感染疾病。

(2)样品的采集与对虾免疫指标及体重增加率的测定

a、样品的采集：实验周期为25天，每5天取样一次，取样时每组随机取30～40尾凡纳滨对虾，在凡纳滨对虾血窦处抽取血淋巴，以1:1(体积比)的比例加入对虾抗凝剂，4℃，800g离心10min，获得血细胞和血清。弃血细胞，血清置于冰上待用；取血后解剖凡纳滨对虾，取肠道，去除肠道内容物后按比例加入以下各种酶活测定试剂盒：多酚氧化酶试剂盒、过氧化物酶试剂盒、酸性磷酸酶活试剂盒、超氧化物气化酶试剂盒、过氧化氢酶试剂盒、溶菌酶试剂盒(上述试剂盒均购于苏州科铭试生物试剂有限公司)中的酶提取液，研磨、离心制备组织样品。

b、凡纳滨对虾血浆非特性免疫相关酶活性的测定：

所取样本中蛋白含量测定用购于苏州科铭试生物试剂有限公司的考马斯亮蓝试剂盒。

蛋白质含量(μg/ml)＝标准蛋白质浓度×(a测定-a空白)÷(a标准-a空白)。

①多酚氧化酶活力的测定

多酚氧化酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本实验定义每mg蛋白在反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位

多酚氧化酶活力(u/mgprot)＝反应总体积/样本体积÷反应时间÷0.01×(a测定-a对照)÷蛋白质浓度(mg/ml)。

②过氧化物酶活力的测定

过氧化物酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本实验定义每ml血清在反应体系中每分钟a470变化0.01为一个酶活力单位。

过氧化物酶活力(u/ml)＝反应总体积÷样本体积÷0.01×δa

上述的公式中δa为在测定时间δt(min)内反应系统在测定波长470nm下的吸光值的变化。

③酸性磷酸酶活力的测定

酸性磷酸酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本实验定义37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。

酸性磷酸酶活力(u/ml)＝[c标准品×(a测定管-a对照管)÷(a标准管-a空白管)×v反应总体积]÷v样(样本体积)×v样本总体积÷t(反应时间)

④超氧化物歧化酶sod活力的测定

超氧化物歧化酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本实验定义在黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制率为50％时，反应中的sod酶活力为一个酶活力单位

抑制百分率＝(a对照管-a测定管)/a对照管×100％

sod活性(u/ml)＝抑制百分率/(1-抑制百分率)

⑤过氧化氢酶活力的测定

过氧化氢酶活力的测定使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。本实验定义每毫升血清每秒分解1μmol的过氧化氢的量为一个活力单位。

过氧化氢酶活力(u/ml)＝(a对照-a测定)×271/(60×取样量)×样本测试前稀释倍数。

⑥溶菌酶活力的测定

以溶壁微球菌(micrococcuslysoleikticus)冻干粉(南京建成生物工程研究所生产)为底物，用0.1mph6.4的磷酸钾缓冲液配制底物悬液，使od570nm≈0.3～0.5；在96孔板中加入血清和菌悬液，血清：菌悬液＝1：10(体积比)，测定570nm处的吸光值即为初始吸光值a0；37℃水浴15min，冰浴3min，测定570nm处的吸光值即为a；溶菌酶活力(u/ml)＝(a0-a)/a。

试验结果显示，喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液的饲料的对虾的多酚氧化酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶sod、过氧化氢酶及溶菌酶活力等特异及非特异免疫酶活相对于对照组对虾均有不同程度的提高，具体结果见图9(图中alf4代表喂食添加本发明的pichiapastoriskm71/ppic9k-fcalf4菌株发酵液饲料的对虾，control代表对照)，从酶活的水平证明了喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾的免疫力明显提高。

c、凡纳滨对虾体长、体重增加率的测定

实验开始前，每组养殖池中随机取出50尾凡纳滨对虾，测定其体长、体重，并分别进行记录l0、w0，饲喂实验结束后，每组养殖池中随机取50尾测定其体长、体重并进行记录l、w。通过计算得出每组对虾的体重增加率：

体长增加率(％)＝(l-l0)/l0×100％

体重增加率(wgr，％)＝(w-w0)/w0×100％

试验结果显示，喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾的体长、体重与对照组相比较显著增加，表明pichiapastoriskm71菌株发酵液的添加对提高对虾体长、体重的增加量具有一定的促进作用，具体结果见图10(图中alf4代表喂食添加本发明的pichiapastoriskm7菌株发酵液饲料的对虾，control代表对照)。

d、养殖对虾攻毒试验后死亡率的测定

在饲喂试验结束后，即投喂实验的第26天，每组取210尾大小均匀的凡纳滨对虾进行攻毒试验，每组的210尾对虾随机分成三个平行。将制备好的致病菌副溶血性弧菌，通过在对虾的第二腹节进行肌肉注射进行攻毒试验，注射菌的浓度为3.58×10⁷cell/ml，注射量为15μl(此剂量经预实验确定)。攻毒完成后，观察对虾存活情况，记录对虾的死亡数量，计算出144h内的对虾死亡率。

实验组和对照组在投喂试验结束后，感染实验期间对虾的累积死亡率结果见图11(图中alf4代表喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾，即实验组，control代表对照)，由图中可知，在受到病原菌感染12小时后，实验组对虾和对照组对虾死亡率开始出现差异，实验组对虾死亡率明显低于对照组，随着感染时间的延长，两组对虾死亡率差异逐渐明显，感染60小时时差异最为显著，整个感染周期实验组对虾的累计死亡率明显低于空白组(p<0.01)，至感染第六天，对照组死亡率为100％，实验组死亡率为71.29％±6.31％，实验结果说明饲料中添加本发明的抗脂多糖多肽对提高对虾对副溶血性弧菌的抵抗能力明显增强，其对对虾的免疫保护率为28.71％±6.31％。

试验结果显示，喂食添加本发明的pichiapastoriskm71菌株发酵液饲料的对虾的体长、体重与对照组相比较显著增加，表明pichiapastoriskm71菌株发酵液的添加对提高对虾体长、体重的增加量具有一定的促进作用，具体结果见图10(图中alf4代表喂食添加本发明的pichiapastoriskm7菌株发酵液饲料的对虾，control代表对照)。

实施例7饲料添加剂对患腹水病半滑舌鳎的免疫保护作用

(1)饲料添加剂添加及饲喂管理

实验组：将半滑舌鳎饲料与实施例5制备的饲料添加剂充分混合，使得混合物中重组菌pichiapastoriskm71的终浓度为1～2×10⁸cfu/g；

空白对照组：不添加发酵液的同样半滑舌鳎饲料。

饲喂：选取体长为9-11cm的患腹水病的半滑舌鳎病鱼，共60尾，均分为空白对照组和实验组，每组的30尾半滑舌鳎随机分为三个平行，每个平行10尾，进行为期2周的投喂实验，投喂过程中，每日按半滑舌鳎体重的5％进行投放饲料，投喂频率为2次/天，投喂1h后捞出未食用饵料，观察半滑舌鳎的存活情况，记录半滑舌鳎存活的数量，计算出2周内半滑舌鳎的存活率。

实验结果，半滑舌鳎的累计存活数量及存活率结果见表4，根据存活率计算平均存活率和标准差，计算结果如表4，在投喂实验第一周内，实验组和对照组半滑舌鳎的存活率开始出现差异，实验组半滑舌鳎存平均活率为100％明显高于对照组76.67％±4.71％，随着投喂时间的延长，两组对虾存活率差异逐渐明显，投喂实验结束时，对照组平均存活率为43.33％±4.71％，实验组存活为76.67％±4.71％，实验结果说明饲料中添加本发明的抗脂多糖多肽对提高半滑舌鳎对腹水病的抵抗能力明显增强，其对半滑舌鳎的免疫保护率为33.34％±4.71％。

表4投喂后各组半滑舌鳎存活尾数

实施例8急性毒性实验

取实施例5的饲料添加剂进行试验

取spf级km小鼠，体重18～22g，雌雄各10只，用实施例5的饲料添加剂进行灌胃，每只每次灌胃0.4ml，24h内灌胃5次，共2ml/只。连续观察7天，第7天称重。结果表明，实验小鼠均未出现异常情况，体重增长正常。说明实施例5的饲料添加剂是安全无毒的。

实施例9饲料组合物

本发明实施例提供了一种饲料组合物，由对虾饲料、实施例5饲料添加剂和海藻酸钠组成；其中，每100g对虾饲料中添加10g海藻酸钠，添加实施例5饲料添加剂20ml，经过调配，使得制备的饲料组合物中pichiapastoriskm71菌液终浓度为3～6×10⁷cfu/g。

实施例10饲料组合物

本发明实施例提供了一种饲料组合物，由对虾饲料、实施例5饲料添加剂和海藻酸钠组成；其中，每100g对虾饲料中添加15g海藻酸钠，添加实施例5饲料添加剂25ml，经过调配，使得制备的饲料组合物中pichiapastoriskm71菌液终浓度为3～6×10⁷cfu/g。

实施例11饲料组合物

本发明实施例提供了一种饲料组合物，由对虾饲料、实施例5饲料添加剂和海藻酸钠组成；其中，每100g对虾饲料中添加5g海藻酸钠，添加实施例5饲料添加剂15ml，经过调配，使得制备的饲料组合物中pichiapastoriskm71菌液终浓度为3～6×10⁷cfu/g。

实施例12

本实施例提供了一种实施例5的饲料添加剂的饲喂对虾的方法，包括如下步骤：

(1)将实施例5的饲料添加剂与饲料混合，其中每100g对虾饲料中添加10g海藻酸钠，添加pichiapastoriskm71菌株发酵液20ml，经过调配，使得制备的饲料中pichiapastoriskm71菌液终浓度为3～6×10⁷cfu/g。

(2)按照对虾体重的5％投放饲料，每天投喂4次，观察养殖池中水的变化并及时进行换水，防止水过于浑浊或残留饲料变质导致对虾生长缓慢或感染疾病，饲喂25天。

实施例13

本实施例提供了一种实施例8的饲料添加剂的饲喂对虾的方法，包括如下步骤：

取实施例8的饲料组合物，按照对虾体重的5％投放饲料，每天投喂4次，观察养殖池中水的变化并及时进行换水，防止水过于浑浊或残留饲料变质导致对虾生长缓慢或感染疾病，饲喂25天。

本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神做举例说明，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做相应的修改和补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所者所附权利要求书所定义的范围。尽管本发明已作出详细的说明书并引证了一些具体实施例，但是对本领域所熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可做相应变化或修正是显然的。

序列表

<110>天津师范大学

<120>巴斯德毕赤酵母菌菌株km71及用途

<130>案卷号？

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>98

<212>prt

<213>人工合成(artificialsynthesis)

<400>1

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151015

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<210>2

<211>363

<212>dna

<213>人工合成(artificialsynthesis)

<400>2

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<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工合成(artificialsynthesisfcalf4-f)

<400>3

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<210>4

<211>55

<212>dna

<213>人工合成(artificialsynthesisfcalf4-r)

<400>4

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