本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种提高忍冬遗传转换效率的方法。
背景技术：
：丁香叶忍冬(学名：loniceraoblata)是忍冬科忍冬属的植物，是中国的特有植物。分布在中国大陆的河北等地，生长于海拔1200米的地区，一般生于多石山坡上。忍冬主要依靠人工栽培来满足市场需求，但产量相对较少，远不能满足市场以及出口的需求，同时在人工栽培中，产量与品质参次不齐，制约了产业的高效发展，因此对如何提高忍冬遗传转换效率就显得尤为重要。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种提高忍冬遗传转换效率的方法，可以显著提高丁香叶忍冬的遗传转换效率。本发明提供了如下的技术方案：一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，s1、获得用于侵染的外植体；s2、获得含有目标基因的重组农杆菌菌液，使用该菌液侵染外植体；s3、培养侵染后的外植体，得到目标基因稳定表达的转基因植株。优选的，s1中，所述外植体获得方法如下，选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60-70％的酒精浸1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟，用无菌水洗2-3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3-4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体。优选的，s2中，所述重组农杆菌为带有gus基因的eha105农杆菌，转化所用载体为pcambia2301。优选的，s2中，侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2-3天，用浓度为od600＝0.3-0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4-20分钟。优选的，所述步骤s3的具体方法为将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1-2天，叶正面朝上转接到含有15-30mg/l的卡那霉素和400-800mg/l的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25±1℃、光照时间10-15h、光照强度1000-2000lx。优选的，所述初代启动培养基的配方为：以mb为基本培养基，并添加6-ba1mg/l、iaa0.8mg/l，调节ph至5.6；所述继代培养基的配方为：以mb为基本培养基，并添加6-ba0.5mg/l、iaa0.8mg/l，调节ph至5.6。优选的，所述分化培养基的配方为：以mb为基本培养基，并添加6-ba1mg/l、kt2mg/l、naa0.1mg/l、调节ph至5.8。优选的，所述筛选培养基的配方为：以mb为基本培养基，并添加dcr2.0mg/l、tdz0.05mg/l、naa20g/l，ph6.0本发明的有益效果是：本发明的重组农杆菌介导的丁香叶忍冬遗传转化方法，该方法重复性强，不受基因型限制，侵染效率能够得到很大提高，转化效率至少为40％，可以提高丁香叶忍冬的转化率。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做具体说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明中mb培养基的组成如下：名称浓度(mg/l)kno31500nh4no3300cacl·2h2o400(mh4)2so4100ki0.5h3bo33.15mnso4·4h2o10znso4·7h2o4.25feso4·7h2o25肌醇100甘氨酸2盐酸硫胺素0.1烟酸0.5实施例1一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，s1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗2次，用质量浓度为5％的次氯酸钠溶液消毒3分钟，用无菌水洗2次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3w的无菌苗叶片作为外植体；s2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2天，用浓度为od600＝0.3的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的eha105农杆菌，转化所用载体为pcambia2301；s3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1天，叶正面朝上转接到含有15mg/l的卡那霉素和400mg/l的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间10h、光照强度1000lx。实施例2一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，s1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用70％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3分钟，用无菌水洗3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；s2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养3天，用浓度为od600＝0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为10分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的eha105农杆菌，转化所用载体为pcambia2301；s3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养2天，叶正面朝上转接到含有30mg/l的卡那霉素和600mg/l的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间12h、光照强度1000lx。实施例3一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，s1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用65％的酒精浸1分钟，无菌水冲洗3次，用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液消毒5分钟，用无菌水洗3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；s2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养3天，用浓度为od600＝0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为15分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的eha105农杆菌，转化所用载体为pcambia2301；s3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养2天，叶正面朝上转接到含有20mg/l的卡那霉素和800mg/l的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25℃、光照时间10h、光照强度1500lx。实施例4一种提高忍冬遗传转换效率的方法，包括如下步骤，s1、选择丁香叶忍冬的茎段的腋芽，洗洁精清洗后用清水冲洗至无泡沫，在超净台中先用60-70％的酒精浸1-2分钟，无菌水冲洗2-3次，用质量浓度为5-10％的次氯酸钠溶液消毒3-5分钟，用无菌水洗2-3次，放入初代启动培养基中诱导腋芽萌发，待腋芽长至3-4cm时，移植到继代培养基中增值，取继代培养3-4w的无菌苗叶片作为外植体；s2、侵染的具体方法为，将外植体置于分化培养基中预培养2-3天，用浓度为od600＝0.3-0.5的重组农杆菌菌液侵染外植体，侵染时间为4-20分钟，所述重组农杆菌为带有gus基因的eha105农杆菌，转化所用载体为pcambia2301；s3、将侵染后的外植体叶正面朝下转接到分化培养基上，黑暗条件下培养1-2天，叶正面朝上转接到含有15-30mg/l的卡那霉素和400-800mg/l的头袍霉素的筛选培养基中培养，培养条件为温度25±1℃、光照时间10-15h、光照强度1000-2000lx。转基因植株的检测分别采用引物对gus-f：catggagtcaaagattcaaat和gus-r：cccgatctagtaacatagatg对实施例1-4中经过筛选培养基筛选配合后的植株(实施例1-4中各选10株)中的目的dna进行pcr鉴定。结果如表1所示，表1检测出目的基因的植株实施例14实施例24实施例35实施例46从表1中可知，实施例1-4中均检测出含有目的基因的植株，平均可达40％以上，效果最好的是实施例4，转基因植株的成功率高达60％。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3