识别茄病镰刀菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株FsD5的制作方法

本发明属于动物领域，特别涉及一种识别茄病镰刀菌的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株fsd5。

背景技术：

半知菌亚门丝孢纲镰刀菌属真菌茄病镰刀菌fusariumsolani是贝母根腐病(亦称干腐病)的病原真菌之一。病原菌为习居菌。病原真菌以菌丝体、孢子及厚垣孢子通过土壤转移传播，主要通过植株的伤口侵入寄主。通过带病的种茎进行远距离传播。贝母根腐病是贝母的重要病害之一，在田间生产期和贮藏期均可为害贝母，被害鳞茎呈蜂窝状，严重影响贝母的产量和质量。由于根腐病发病部位主要为地下的鳞茎，田间症状难以在早期发现，加上镰刀菌属真菌种类繁多，近缘种的菌落、菌丝和孢子形态相似，难以依靠形态特征加以区分，因此，根腐病的早期诊断和病原菌的分类鉴定一直是制约着贝母根腐病科学有效防治的难题。本发明公开的针对茄病镰刀菌的单抗结合酶联免疫吸附试验(elisa)由于具有灵敏度高、特异性强、适于大量检测植物、动物、微生物样品的特点，为应用该抗体进行茄病镰刀菌的鉴定和生物学研究，由茄病镰刀菌感染的病害如贝母根腐病等的发生动态监测奠定基础。

技术实现要素：

本发明提供了一种识别茄病镰刀菌的单克隆抗体，由保藏编号为：cctccno：c2019224的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为fsd5，于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：cctccno：c2019224。

本发明具有如下有益效果：

(1)单克隆抗体的特异性强：该单克隆抗体与茄病镰刀菌抗原反应强，且不与链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、半裸镰刀菌、灰葡萄孢菌、茎点霉菌、拟茎点霉菌的抗原发生反应，可用于茄病镰刀菌及其引发的浙贝母根腐病的检测。

(2)单克隆抗体的检测灵敏度高：采用间接elisa检测结果表明，该单克隆抗体对茄病镰刀菌菌丝及孢子制备的抗原的检测灵敏度为12.21ng/ml(即每孔1.221ng)，具有良好的开发应用前景。

(3)单克隆抗体的类型为igκ。

(4)单克隆抗体结合的目标蛋白单一：该单克隆抗体仅与茄病镰刀菌约100kda的抗原蛋白结合。

(5)浙贝母对单克隆抗体的检测灵敏度无影响：该单克隆抗体对浙贝母蛋白提取液无存在交叉反应；在茄病镰刀菌菌丝及孢子制备的抗原中加入浙贝母蛋白提取液后，浙贝母提取液对单抗的检测灵敏度无影响，仍为12.21ng/ml(即每孔1.221ng)，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1fsd5的效价检测；

图2fsd5与不同真菌抗原的反应；

图3fsd5的检测灵敏度测定；

图4fsd5抗体的类型及亚类鉴定；

图5fsd5抗体结合的茄病镰刀菌目标蛋白；

图6浙贝母蛋白提取液对fsd5的检测灵敏度的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施实例进一步解释本发明。

实施例1：杂交瘤细胞株制备

(1)抗原的准备：挑取茄病镰刀菌的单菌落分别接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在25℃下振荡培养4～5d后，用50ml离心管收集孢子和菌丝，6000r/min离心20min，用pbs洗涤2次后，超声破碎(功率200w，破碎2s，间歇2s)，将破碎液在6000r/min离心20min，收集上清液，用考马斯亮蓝法测上清蛋白含量，调整蛋白浓度为1000μg/ml，作为免疫抗原，将抗原液少量分装后-80℃冰冻保存。在临用前取少量于-20℃保存。

(2)选取10～12周龄的健康balb/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μl。3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μl。再过3周后用不加佐剂的抗原免疫及后期检测用初始抗原。最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗体)，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合。

(3)采用聚乙二醇(peg-4000)作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为sp2/0。整个过程在无菌条件下操作。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50ml离心管中，混合离心(1200r/min，2min)后，吸尽上清液，以手指弹匀细胞。将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂(50％peg)0.7ml。静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的rmpi-1640培养基40ml，使peg稀释而失去作用。离心后(1000r/min，2min)弃上清液。将沉淀的细胞悬于40mlhat培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5％(v/v)co2温箱中在37℃下培养。3天后换一半hat培养基，5天后再换一半hat培养基，再5天改用ht培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞。

(4)当小孔中细胞生长到覆盖孔底四分之一面积时，即可吸取上清液用间接elisa检测抗体。选出强阳性且不与木贼镰刀菌、灰葡萄孢菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单抗的细胞株fsd5，细胞株fsd5进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。该杂交瘤细胞于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：cctccno：c2019224。

实施例2：单抗的产生

取8周龄左右balb/c小鼠，腹腔注射0.3ml降植烷，7-10天后腹腔注射5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，2000r/min离心3min，收集上清液，即为腹水型单抗。proteina柱层析纯化单抗，-80℃保存。fsd5细胞株制备得单抗，即为可专一识别茄病镰刀菌的单抗。

实施例3：单抗的效价检测实验

采用间接elisa方法测定抗体的效价。将1000μg/ml的茄病镰刀菌抗原用包被液稀释1000倍后包被整块酶标板(即1μg/ml)，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔，pbst洗涤三次后用脱脂奶封闭60min。将单抗fsd5倍比稀释加入包被孔，每孔加100μl，37℃，1h，pbst洗涤三次后加入按说明书稀释5000倍的辣根过氧化酶标记兔抗鼠(sigma公司)100μl孔，37℃1h，pbst洗涤后加opd底物显色液显色，使用50μl2m的h2so4终止反应后，用酶标仪读取od490nm，以与阴性比值大于2为阳性测定单抗腹水效价。

经检测，确定fsd5的效价为稀释5.12×10⁶倍，确定fsd5稀释20000倍用于其他检测实验(如图1)。

实施例4：单抗的特异性检测实验

检测对象分别是木贼镰刀菌、灰葡萄孢菌、半裸镰刀菌、链格孢菌、细极链格孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、茎点霉菌和拟茎点霉菌，将上述抗原(1000μg/ml)用包被液稀释至1μg/ml后包被酶标板。以包被液为空白对照，用间接elisa法检测抗体的特异性，其中单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

经上述检测该抗体和上述真菌的抗原均不发生交叉反应，但该抗体与茄病镰刀菌抗原反应强烈，可以明显判别是否存在茄病镰刀菌抗原(图2)。

实施例5：单抗的灵敏度检测实验

采用间接elisa方法测定单抗的灵敏度。将1000μg/ml的茄病镰刀菌抗原用碳酸盐包被液倍比稀释为1:80×2⁰～1:80×2¹⁰，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复8次，第12列为空白对照，仅用包被液包被。单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

通过检测得1000μg/ml的茄病镰刀菌抗原的最大稀释倍数为81920倍，即检测灵敏度为：1000μg/ml÷81920＝12.21ng/ml(图3)。

实施例6：单抗的类型及亚类检测实验

采用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒(佰奥通实验材料中心，批号：c060101-l)对单抗进行鉴定。取1000μg/ml的茄病镰刀菌抗原用包被液稀释1000倍后包被酶标板，100μl/孔，重复16孔，置37℃温育2h或4℃放罝12h，甩去包被液后用pbst洗涤1次。取100μl用pbst稀释20000倍的腹水型单抗加入酶标板各孔，置37℃温育30min，用pbst洗涤5次，取试剂盒中8种检测抗体ig类型及亚类的酶标抗体各100μl，分别加入各孔，每种酶标抗体设2个重复，置37℃温育30min，pbst洗涤5次，加opd显色液避光显色20min，用50μl2m的h2so4终止反应。酶标仪检测od490nm，阳性孔所对应的抗体ig类型及亚类即为该单抗的抗体类型及亚类。

经检测，确定fsd5的抗体类型为igκ(图4)。

实施例7：该单抗结合蛋白的检测实验

采用sds-page及westernblot技术对抗体结合蛋白进行检测，步骤如下：

(1)制备5％(m/v)的浓缩胶和10％(m/v)的分离胶。

(2)取80μl茄病镰刀菌抗原和20μl的5×样品缓冲液混合于1.5ml离心管中，99℃金属浴10min后立即放入冰浴中3min，然后10000r/min离心5min。

(3)用微量加样器将样品加入样品孔，每样加2个孔，同时加蛋白marker。

(4)电泳：先80v恒压，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，再改为120v恒压，当溴酚蓝指示剂移到凝胶板下口约1cm时停止电泳。

(5)将凝胶分成两部分，将一半浸入染色液中，于摇床上染色45min，换脱色液脱色，至背景清晰为止。

(6)将另一半凝胶用半干转印法在25v恒压下转印30min，转移蛋白至硝酸纤维素膜上。

(7)转印后的膜用pbst洗涤4次，每次5min。

(8)将膜浸入3％(m/v)脱脂奶中，室温封闭1h。

(9)将膜浸入用3％(m/v)脱脂奶稀释2000倍的腹水型单抗溶液中，室温下75r/min摇动1h后，4℃孵育过夜。

(10)同(7)洗涤。

(11)将膜浸入用3％(m/v)bsa稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记抗体，室温75r/min摇动1h。

(12)同(7)洗涤。

(13)将膜浸入10ml新配制的dab显色液中，避光缓慢摇动直到显色，用蒸馏水终止显色反应。膜上显色的条带即为抗体所结合的特异性蛋白，根据蛋白marker计算结合蛋白的相对分子量。

经检测，该抗体与茄病镰刀菌相对分子量约100kda的蛋白特异性结合(图5)。

实施例8：浙贝母对单抗灵敏度的影响实验

采用间接elisa方法测定茄病镰刀菌的宿主植物浙贝母对单抗检测灵敏度的影响。取新鲜浙贝母植株(包括鳞茎)，超声破碎(功率200w，破碎2s，间歇2s)10min，6000r/min离心10min，取上清液，用包被液稀释20倍备用。将1000μg/ml的茄病镰刀菌抗原用上述浙贝母稀释液稀释1:40×2⁰～1:40×2¹¹，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复8次，以不加茄病镰刀菌抗原的浙贝母稀释液包被酶标板作为阴性对照。单抗稀释20000倍，酶标二抗稀释5000倍。

经检测，fsd5对浙贝母蛋白提取液无交叉反应。加入浙贝母蛋白提取液后，茄病镰刀菌抗原的检测灵敏度为12.21ng/ml，表明浙贝母提取液对检测结果无影响(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上事实例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。