一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用与流程

本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用。

背景技术：

据世界卫生组织(who)报告：全球每7对夫妇中约有1对存在生殖障碍，不孕不育症影响全世界大约10％～15％的人口。我国不孕不育症的发病率呈逐年上升的趋势，而在一些经济发达的沿海地区，由于受环境污染、工作压力等因素的影响，致使不孕不育患者超过20％，特别是在具有代表性的广东地区，10对夫妇中有超过两对半因各种原因而患有不孕不育症。统计显示，在女性不孕症病因中，内分泌功能障碍所致卵泡发育不良综合症占据全部不孕病因的48.42％，居女性不孕症病因首位。

人促卵泡激素(humanfollicle-stimulatinghormone，以下简称hfsh)，是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白，主要作用为促进卵泡成熟。促卵泡激素可以促进卵泡颗粒层细胞增生分化，并促进整个卵巢长大。重组人促卵泡激素(rhfsh)临床主要用于不孕症治疗，目前我国批准的适应症有：用于不排卵(包括多囊卵巢综合征，pcos)且对枸橼酸克罗米芬治疗无效者；用于辅助生殖技术超促排卵，如体外受精-胚胎移植(ivf-et)、配子输卵管内移植(gift)及卵胞浆内精子注射(icsi)，以获得多个卵泡发育。

虽然目前已有利用cho细胞生产的重组药物hfsh上市，但是重组hfsh表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。另外，hfsh是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证fsh的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。

技术实现要素：

针对现有rhfsh重组表达的缺陷，本发明利用优化的分子生物学技术、细胞生产和纯化工艺开发新型的rhfsh产品，采用cho细胞表达系统，将hfsh的α和β亚基在基因水平密码子优化，构建到同一载体中进行共表达，并在无血清培养的条件下分析工程细胞的生长和表达特性，建立异二聚体糖蛋白激素高表达技术。解决现有技术中rhfsh表达量低、纯化难、体内活性低的问题。

本发明的一个目的是提供一种含有α和β链的重组rhfsh异二聚体。

本发明的一个目的是提供一种编码hfshβ链的dna序列，其碱基序列如seqidno:1所示。该序列针对哺乳动物细胞cho表达系统进行了密码子优化，其更利于hfshβ链在哺乳动物细胞cho中表达。

本发明的另一个目的是提供一种rhfshβ链，其氨基酸序列如seqidno:3所示。

本发明还在上述所述编码rhfshβ链基因之前加入分泌信号肽，其碱基序列如seqidno:4所示，其氨基酸序列如seqidno:5所示。该分泌信号肽序列是专为hfshβ链在哺乳动物细胞分泌表达到胞外设计，可显著提高hfshβ链在宿主细胞中的分泌效率。

本发明的一个目的是提供一种编码hfshα链的dna序列，其碱基序列如seqidno:6所示。该序列针对哺乳动物细胞cho表达系统进行了密码子优化，其更利于hfshα链在哺乳动物细胞cho中表达。

本发明的另一个目的是提供一种hfshα链，其氨基酸序列如seqidno:8所示。

本发明还在上述所述编码rhfshα链基因之前加入分泌信号肽，其碱基序列如seqidno:9所示，其氨基酸序列如seqidno:10所示。该分泌信号肽序列是专为hfshα链在哺乳动物细胞分泌表达到胞外设计，可显著提高hfshα链在宿主细胞中的分泌效率。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后hfshβ链与hfshα链基因的质粒，所述的质粒为：pcdna3、pcmv/zeo、plres、pdr、pbk、psport、pcdna3.3、poptivec、pcho1.0，优选为pcdna3.3、poptivec或pcho1.0。

所述质粒更优选为pcho1.0，且所述hfshβ链基因插入在avrii和bstz17i酶切位点之间，所述hfshα链基因插入在ecorv和paci酶切位点之间。

所述的哺乳动物宿主细胞包括cho、hek293、cos、bhk、ns0和sp2/0细胞。优选，cho细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的dg44或cho-s细胞。

本发明另一个目的是提供一种rhfsh异二聚体的制备方法，该制备方法包括：

1)构建编码同时含有rhfshβ链和hfshα链基因的表达质粒；

2)rhfsh基因导入宿主细胞以及异二聚体组装，细胞株筛选；

3)rhfsh细胞株高密度培养；

4)rhfsh纯化制备。

本发明的目的在于提供一种高效表达rhfsh异二聚体的细胞培养方法，所述培养方法的步骤如下：

1)将上述rhfsh重组cho-s细胞复苏活化后，利用无血清基础培养基重悬后获得种子细胞溶液；

2)利用无血清基础培养基传代培养步骤1)所得的种子细胞，培养结束后获得细胞悬液；

3)将步骤2)所得的细胞悬液接种到摇瓶或细胞反应器中进行培养，培养过程中定期流加补料培养基，检测细胞生长情况，并补充葡萄糖溶液；

4)培养结束后收获细胞。

本发明的另一个目的是提供一种rhfsh异二聚体纯化方法，所述纯化方法如下：

1)将上述rhfsh培养液高速离心收集上清，0.45μm滤膜过滤。

2)亲和层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，将步骤1)中预处理的细胞培养液通过亲和填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液和洗脱缓冲液ph＝7.4。

3)阳离子交换层析，将步骤2)中亲和层析收集峰，通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液ph＝5.0，洗脱缓冲液ph＝6.0。

本发明具有工艺简单、目的产物产量高、纯度高、体内活性好以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等优点。

附图说明

图1表示优化前后rhfshβ链基因序列对比图。

其中，优化前序列对应的为天然hfshβ链基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本发明的rhfshβ亚基的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a，2-b为优化前后hfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的cai指数。

其中，图2-b表示天然hfshβ链基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.85；图2-a表示优化后的本发明的hfshβ链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.96。

图3-a，3-b为密码子优化前后hfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中图3-b表示hfshβ链天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：hfshβ链天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为3％；图3-a表示优化后的本发明的hfshβ链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的hfshβ链密码子序列低利用率密码子出现为0。

图4-a，4-b为密码子优化前后hfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量分布区域图。

其中，图4-b表示hfshβ链天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：49.84％；图4-a表示优化后的本发明的hfshβ链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：55.39％。

图5表示优化前后rhfshα链基因序列对比图。

其中优化前序列对应的为天然hfshα链基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本发明的rhfshα链的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图6-a，6-b为优化前后hfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的cai指数。

其中，图6-b表示天然hfshα链基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.73；图6-a表示优化后的本发明的hfshα链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数经程序计算为0.96。

图7-a，7-b为密码子优化前后hfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中图7-b表示hfshα链天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：hfshα链天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为12％；图7-a表示优化后的本发明的hfshα链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的hfshα链密码子序列低利用率密码子出现为0。

图8-a，8-b为密码子优化前后hfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量分布区域图。

其中，图8-b表示hfshα链天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：49.79％；图8-a表示优化后的本发明的hfshα链密码子在哺乳动物细胞cho表达系统中平均gc碱基含量为：55.95％。

图9为密码子优化后rhfshβ链和α链两个基因pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。

泳道1为500bpdnaladder，泳道2为两端含有ecorv和paci酶切位点的rhfshα链基因pcr产物，泳道3为两端含有avrii和bstz17i酶切位点的rhfshβ链基因pcr产物。

图10-a，10-b为密码子优化后hfsh中β链和α链共表达质粒pcho1.0-hfsh构建过程图。

其中，图10-a为密码子优化后β链单表达质粒pcho1.0-hfshβ构建过程图，图10-b为密码子优化后含有β链和α链共表达质粒pcho1.0-hfsh构建过程图。

图11为密码子优化后rhfsh稳定表达细胞株在摇瓶中培养液上清sds-page凝胶电泳图。

其中，泳道1为10-100kd范围的预染蛋白上样marker，泳道2-10分别为rhfsh稳定表达细胞株第7-15天上清培养液。

图12为密码子优化后rhfsh稳定表达细胞株在3l细胞反应器中培养液上清sds-page凝胶电泳图。

其中泳道1为10-100kd范围的预染蛋白上样marker，泳道2-10分别为rhfsh稳定表达细胞株第7-15天上清培养液。

图13为rhfsh在3l细胞反应器培养液第一步亲和层析凝胶电泳图。

其中，泳道1为10-100kd非预染蛋白marker，泳道2-8为各洗脱收集管。

图14为rhfsh稳定表达细胞株培养液第二步阳离子层析凝胶电泳图。

其中，泳道1为10-100kd非预染蛋白marker，泳道2-3为rhfsh两批次洗脱收集合并样品。

图15为两批次纯化获得rhfsh蛋白sec-uplc纯度分析色谱图，结果表明纯度均大于95％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1rhfshβ和α链密码子优化

步骤1：rhfshβ链密码子优化

发明人根据ncbi已公开的homosapiensfolliclestimulatinghormonebetasubunit的dna序列(ncbi登录号：nm_000510.2)中基因序列，如seqidno：2所示，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rhfshβ链基因，核苷酸序列如seqidno：1所示，氨基酸序列如seqidno：3所示，并对上述rhfshβ链基因的信号肽进行筛选和密码子优化，得到本发明rhfshβ链在cho中分泌高效表达信号肽序列，其核苷酸序列如seqidno：4所示，氨基酸序列如seqidno：5所示。

下面是对rhfshβ链密码子优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(cai)

由图2-b可知，密码子没有优化前，rhfshβ链原始基因在哺乳动物细胞cho表达系统中密码子适应指数(cai)为0.85。由图2-a可知，通过密码子优化，rhfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数为0.96。通常cai＝1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，cai指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高hfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的表达水平。

2.最优密码子使用频率(pop)

由图3-b知，基于哺乳动物细胞cho表达系统，密码子没有优化前，rhfshβ链基因序列的低利用率密码子(利用率低于40％的密码子)出现百分比为3％。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-a可知，通过密码子优化后，rhfshβ链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.gc碱基含量(gccurve)

gc含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的rhfshβ链基因的gc碱基平均含量分布区域图对比可知，图4-b中显示rhfshβ链基因gc碱基平均含量为49.84％，图4-a中显示出优化后去除在30％-70％区域外出现的gc含量峰值，最终得到优化后rhfshβ的gc碱基平均含量为55.39％。

步骤2：rhfshα链密码子优化

发明人根据ncbi已公开的homosapiensglycoproteinhormones,alphapolypeptide(cga)的dna序列(ncbi登录号：nm_000735.3)，如seqidno：7所示，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rhfshα链基因，核苷酸序列如seqidno：6所示，氨基酸序列如seqidno：8所示，并对上述rhfshα链基因的信号肽进行筛选和密码子优化，得到本发明rhfshα链在cho中分泌高效表达信号肽序列，其核苷酸序列如seqidno：9所示，氨基酸序列如seqidno：10所示。

下面是对rhfshα链密码子优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(cai)

由图6-b可知，密码子没有优化前，rhfshα链原始基因在哺乳动物细胞cho表达系统中密码子适应指数(cai)为0.73。由图6-a可知，通过密码子优化，rhfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中cai指数为0.96。通常cai＝1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，cai指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高hfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中的表达水平。

2.最优密码子使用频率(pop)

由图7-b可知，密码子没有优化前，rhfshα链基因序列的低利用率密码子出现百分比为12％。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图7-a可知，通过密码子优化后，rhfshα链基因在哺乳动物细胞cho表达系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.gc碱基含量(gccurve)

由图8-a、图8-b的rhfshα链基因的gc碱基平均含量分布区域图对比可知，图8-b中显示hfshα链基因gc碱基平均含量为49.79％，图8-a中显示出优化后去除在30％-70％区域外出现的gc含量峰值，最终得到优化后rhfshα链的gc碱基平均含量为55.95％。

实施例2：rhfshβ链和α链共表达质粒构建

步骤1：rhfshβ链单表达质粒构建

将优化后的信号肽与rhfshβ链直接融合，并在5’端引入avrii酶切位点序列，在3’端引入bstz7i酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到puc57质粒中，得到一种长期保存质粒，记为puc57-rhfshβ质粒。以puc57-rhfshβ质粒为模板，进行pcr扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

m13f:cgccagggttttcccagtcacgac

下游引物：

m13r:agcggataacaatttcacacagga

反应总体积50μl，其中浓度为10μmol/l引物各加2.5μl，浓度为10mmol/l的dntp加1μl，所用dna聚合酶为q5(#m0491l，购自newenglandbiolabs公司)，2u/μl，加0.5μl。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(420bp)一致(结果如图9所示)。

用avrii(#r0174s，购自newenglandbiolabs公司)和bstz17i(#r0594s，购自newenglandbiolabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用dna凝胶回收试剂盒(dp214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。用t4连接酶(#m0202s，购自newenglandbiolabs)连接到pcho1.0质粒(购自life公司)中，转化到top10感受态细胞(cb104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有卡那霉素(0408，购自amresco公司)的lb固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌进行pcr鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到rhfshβ密码子优化后的表达质粒，记为pcho1.0-rhfshβ(质粒构建如图10-a所示)。步骤2：rhfshβ链和α链共表达质粒构建

将优化后信号肽与rhfshα链直接融合，并在基因5’端引入ecorv酶切位点序列，在3’端引入paci酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到puc57质粒中，得到一种长期保存质粒，记为puc57-rhfshα质粒。以puc57-rhfshα质粒为模板，进行pcr扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

m13f:cgccagggttttcccagtcacgac

下游引物：

m13r:agcggataacaatttcacacagga

反应总体积50μl，其中浓度为10μmol/l引物各加2.5μl，浓度为10mmol/l的dntp加1μl，所用dna聚合酶为q5，2u/μl，加0.5μl。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(380bp)一致(结果如图9所示)。

用ecorv(#r3195s，购自newenglandbiolabs公司)和paci(#r0547s，购自newenglandbiolabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用dna凝胶回收试剂盒纯化。用t4连接酶连接到pcho1.0-rhfshβ质粒中，转化到top10感受态细胞中，在含有卡那霉素的lb固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌进行pcr鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到rhfsh的β和α链共表达质粒，记为pcho1.0-rhfsh(质粒构建如图10-b所示)。

实施例3：rhfsh稳定表达细胞株加压筛选

puromycin为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除puromycin毒性的作用。pcho1.0载体含有pac基因，因此可利用puromycin作为pcho1.0为表达载体的筛选抗生素。mtx为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制dhfr的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。pcho1.0含有dhfr基因，可利用mtx作为筛选试剂。利用转染后的细胞含有puromycin和mtx抗性基因，不断增加筛选试剂的浓度来增加阳性细胞中目的基因拷贝数从而提高表达量。

将测序正确的pcho1.0-rhfsh质粒用nrui限制内切酶(#r0192s，购自newenglandbiolabs公司)线性化，电转染到cho-s宿主细胞中后，分别加入低浓度的puromycin(a1113802，购自life公司)和mtx(m8407，购自sigma-aldrich公司)置于二氧化碳培养箱中37℃，8％co2进行加压筛选。10天后计算细胞活率，当细胞活率大于30％以上转移到摇床中，37℃，8％co2，130rpm悬浮培养，并不断提高puromycin和mtx浓度加压筛选提高目的基因拷贝数从而提高表达量。

实施例4：rhfsh稳定表达细胞株摇瓶培养

将rhfsh稳定表达细胞株接种于dynamis培养基(a2617501，购自thermofisher公司)中，37℃，8％co2，130rpm摇床中培养。

第4天，取样并计算细胞密度，当细胞密度达到5×10⁶cells/ml后，加入葡萄糖至终浓度4g/l和补充培养体积10％的补料培养基cdefficientfeed^tmc(a2503104，购自thermofisher公司)至培养基中。

每天计算细胞密度，第6，8，10，12，14天加入葡萄糖至终浓度为4g/l和补充培养体积5％的补料培养基cdefficientfeed^tmc至培养基中。

第15天收集上清培养液或者检测细胞的活率和密度，当细胞的活率不低于80％时收集上清培养液。随着葡萄糖和cdefficientfeed^tmc分批补料流加，不同时间rhfsh稳定表达细胞株培养液sds-page凝胶电泳图11，结果显示，rhfsh在哺乳动物细胞cho-s中，通过小试摇瓶表达，能够组装较高表达量的β和α链的异二聚体。

实施例5：rhfsh稳定表达细胞株反应器高密度培养

从-150℃冰箱取出rhfsh种子细胞后，于37℃水浴融化后，取细胞悬液于15ml离心管内，1000rpm离心5min，弃上清。用37℃预热的新鲜基础培养基dynamis重悬后，所述基础培养基于125ml透气摇瓶培养，培养体积30ml，培养条件为转速130rpm，温度37℃，湿度75％，8％co2。种子扩增按照125ml摇瓶-250ml摇瓶顺序逐级传代，经过7d的扩增，细胞培养体积达到100ml，密度为3.0～6.0×10⁶cells/ml。

取种子悬液接种3l生物反应器，接种后培养体积为1.5l，密度5×10⁵cells/ml。初始培养

条件为：转速100，溶氧40％，温度37℃，ph值7.0。在反应器培养的第4，6，8，10，12d分别补充培养体积5％的补料培养基cdefficientfeed^tmc，每日监测细胞活率、生长密度、葡萄糖和乳酸的含量。补充400g/l的葡萄糖溶液来维持培养液的糖含量不低于4g/l，当细胞活率低于90％时，收集培养液进行纯化，不同时间rhfsh稳定表达细胞株培养液sds-page凝胶电泳图12，结果显示，rhfsh在哺乳动物细胞cho-s中，通过细胞反应器高密度培养，能够组装具备产业化放大规模产量的β和α链的异二聚体。

实施例6：rhfsh蛋白纯化

1.培养液预处理

按实施例5得到rhfsh培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.45收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，可进行层析纯化。

2.柱层析

平衡缓冲液a(20mmtris-hcl，ph7.4)平衡层析柱后，过captureselect^tmfolliclestimulatinghormone(fsh)affinitymatrix(1943180250，购自thermofisher公司)填料装填的层析柱，用洗脱缓冲液a(20mmtris-hcl，2mmgcl2，ph7.4)洗脱。结果见图13，由sds-page凝胶电泳图可见经过一步亲和纯化，rhfsh纯度达到90％以上。再通过hitrapcaptos阳离子交换层析，实现目标蛋白精纯和换液，用平衡缓冲液b(50mmnah2po4，ph5.0)平衡层析柱后，样品用双蒸水稀释电导至3.0-3.5ms之间，captos柱子结合后，用洗脱缓冲液b(50mmnah2po4，1mnacl，ph6.0)线性洗脱。纯化后的hfsh融合蛋白进行sds-page凝胶电泳分析，图14为两批次反应器经过两步纯化sds-page凝胶电泳图，并进行uplc-sec纯度分析，纯度达到99％以上(见图15)。

分析两批次rhfsh纯化产量，得到99％纯度以上的rhfsh产量高于200mg/l，由此推算，今后再经过稳定表达单克隆细胞株筛选和反应器工艺优化，在规模化放大生产中反应器中产量能达到1g/l左右，由此可见本发明具有工艺简单、目的产物产量高、纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

实施例7：rhfsh蛋白的体内活性测定

本发明的rhfsh蛋白的体内活性采用《中国药典》2015版1216卵泡刺激素生物测定法进行检测，系比较绒促性素标准品(s)与供试品(t)对幼大鼠卵巢增重的作用，以测定供试品的效价。

1.试验当日，称取牛血清白蛋白适量，加0.9％氯化钠溶液溶解，制成每1ml中含1mg的溶液，充分溶解后，用1mol/l氢氧化钠溶液调节ph＝7.2。

2.试验当日，按标准品gonal-f(购于默克雪兰诺有限公司，n-19z8803b)的标示效价，用上述牛血清白蛋白溶剂按高、中、低剂量组(4u/ml、2u/ml、1u/ml)配成3种浓度的稀释液。标准品溶液置2-10℃贮存，可供3日使用。

3.将实施例6制备的rhfsh蛋白的估计效价,按照标准品溶液的制备法制成高、中、低(0.594μg/ml、0.297μg/ml、0.148μg/ml)3种浓度的稀释液。

4.取健康合格，体重36～60g，同一来源的雌性幼大鼠，一次试验所用大鼠的体重相差不得超过15g，按体重随机等分成6组，每组不少于8只。每日于大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品或供试品溶液0.5ml，每日1次，连续注入3次，于最后1次注入24小时后，将动物处死，称重，解剖，摘出卵巢，剥离附着的组织，去除输卵管，用滤纸吸去周围的液体，直接称重(天平精密度为0.1mg)并换算成每10g体重的卵巢重，照生物检定统计法(通则1431)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差。

测得rhfsh体内效价为5.1891u/ml，即13130u/mg，结果表明，本发明的rhfsh蛋白具有非常好的生物学活性。

序列表

<110>江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120>一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用

<130>一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>336

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

aacagctgcgagctgaccaatatcacaatcgctatcgagaaggaggagtgcaggttctgt60

atctctatcaacaccacatggtgcgccggctactgttataccagggacctggtgtacaag120

gatcccgctcggcctaagatccagaagacctgcaccttcaaggagctggtgtatgagaca180

gtgagagtgccaggctgtgcccaccatgctgactccctgtacacctatcccgtggccaca240

cagtgccactgtggcaagtgcgactccgatagcaccgattgtacagtgcgcggcctgggc300

ccctcttactgttccttcggcgagatgaaggagtga336

<210>2

<211>336

<212>dna

<213>homosapiens

<400>2

aatagctgtgagctgaccaacatcaccattgcaatagagaaagaagaatgtcgtttctgc60

ataagcatcaacaccacttggtgtgctggctactgctacaccagggatctggtgtataag120

gacccagccaggcccaaaatccagaaaacatgtaccttcaaggaactggtatacgaaaca180

gtgagagtgcccggctgtgctcaccatgcagattccttgtatacatacccagtggccacc240

cagtgtcactgtggcaagtgtgacagcgacagcactgattgtactgtgcgaggcctgggg300

cccagctactgctcctttggtgaaatgaaagaataa336

<210>3

<211>111

<212>prt

<213>homosapiens

<400>3

asnsercysgluleuthrasnilethrilealaileglulysgluglu

151015

cysargphecysileserileasnthrthrtrpcysalaglytyrcys

202530

tyrthrargaspleuvaltyrlysaspproalaargprolysilegln

354045

lysthrcysthrphelysgluleuvaltyrgluthrvalargvalpro

505560

glycysalahishisalaaspserleutyrthrtyrprovalalathr

65707580

glncyshiscysglylyscysaspseraspserthraspcysthrval

859095

argglyleuglyprosertyrcysserpheglyglumetlysglu

100105110

<210>4

<211>54

<212>dna

<213>homosapiens

<400>4

atgaagaccctgcagttctttttcctgttttgctgttggaaggccatctgctgt54

<210>5

<211>18

<212>prt

<213>homosapiens

<400>5

metlysthrleuglnphephepheleuphecyscystrplysalaile

151015

cyscys

<210>6

<211>279

<212>dna

<213>homosapiens

<400>6

gcccctgacgtgcaggattgcccagagtgtacactgcaggagaaccccttcttttctcag60

ccaggagctccaatcctgcagtgcatgggatgctgtttctccagggcttaccccacccct120

ctgcggagcaagaagacaatgctggtgcagaagaatgtgacctccgagagcacatgctgc180

gtggccaagtcctataaccgcgtgaccgtgatgggcggctttaaggtggagaatcacacc240

gcttgccattgttctacatgttactatcacaagtcctga279

<210>7

<211>279

<212>dna

<213>homosapiens

<400>7

gctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccag60

ccgggtgccccaatacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactcca120

ctaaggtccaagaagacgatgttggtccaaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgt180

gtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttcaaagtggagaaccacacg240

gcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatcttaa279

<210>8

<211>92

<212>prt

<213>homosapiens

<400>8

alaproaspvalglnaspcysproglucysthrleuglngluasnpro

151015

phepheserglnproglyalaproileleuglncysmetglycyscys

202530

pheserargalatyrprothrproleuargserlyslysthrmetleu

354045

valglnlysasnvalthrsergluserthrcyscysvalalalysser

505560

tyrasnargvalthrvalmetglyglyphelysvalgluasnhisthr

65707580

alacyshiscysserthrcystyrtyrhislysser

8590

<210>9

<211>72

<212>dna

<213>homosapiens

<400>9

atggactactatagaaagtacgccgctatcttcctggtgaccctgagcgtgtttctgcac60

gtgctgcattct72

<210>10

<211>24

<212>prt

<213>homosapiens

<400>10

metasptyrtyrarglystyralaalailepheleuvalthrleuser

151015

valpheleuhisvalleuhisser

20