一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种简便、快速分离空气中禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基。

背景技术：

fusariumheadblight(fhb)是一种全球小麦和大麦的毁灭性病害。这种病害不仅会造成严重的产量损失，还会导致食品和饲料行业使用的谷物真菌毒素污染，造成巨大的间接损失。在中国，禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)和亚洲镰刀菌(fusariumasiaticum)是引起麦类赤霉病的主要病原菌，占分离比例的90％以上，称为禾谷镰刀菌复合种群(fusariumgraminearumspeciescomplex，fgsc)；美洲和欧洲的主要病原菌是禾谷镰刀菌(f.graminearum)。禾谷镰刀菌在其生命周期中经历无性和有性阶段(gibberrllazeae)。无性阶段产生分生孢子，而有性阶段产生子囊孢子，这种子囊孢子是在深黑色子实体中产生的，称为子囊果(perithecia)。分生孢子和子囊孢子都可以引发小麦植株感染(shaner,2003)，其中子囊孢子是引发赤霉病主要初侵染源。

在自然界中，赤霉病菌的有性阶段发生在作物后期成熟阶段，通常在玉米和小麦秸秆的表面上形成子囊果，例如玉米茬、水稻茬等。子囊孢子可以从成熟的子囊中弹射而出，并通过风飞散以侵染小麦；这个过程正与生长季节的大小麦开花期同时发生，因而来自于田间病残体上的子囊果是小麦赤霉病最主要的初侵染源。监测田间子囊孢子数目可以为病害流行与发生提供科学数据，再结合气象资料可预测预报该病害发生的流行趋势。

目前，从发病麦穗(粒)上分离小麦赤霉病菌的方法和技术比较成熟与容易，现有技术中已有一些从土壤或寄主植物和种子中分离镰刀菌的报道。例如张艺萍发明了“一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法”的培养基，使用了青霉素、链霉素、利福平和杀真菌剂五氯硝基苯作为选择性培养基分离尖孢镰刀菌(fusariumoxysporumschlechtendfr.)的配方，这种方法可以很好的分离大多数的镰刀菌(cn103074238a)；景晓辉等(2009)介绍了一种简便分离香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cubense)的选择性培养基，这种培养基无需无菌操作，可以从土壤中分离出香蕉枯萎病菌，菌落典型，是一种较为理想的选择性培养基。利用上述的培养基虽然也可以分离空气中镰刀菌，但空气中镰刀菌的种类非常丰富，而造成小麦赤霉病的主要是禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌，用上述培养基分离到更多的是非禾谷镰刀菌复合种群，如何找到一种能够快速鉴别出禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌的分离方法和培养基，是本发明的技术难点。

对病害发生进行预测预报，是防控植物病害的一种有效手段。小麦赤霉病是一种气传性病害，田间子囊孢子是其最主要的初侵染源，如果能够监测子囊孢子的数量，则可以对赤霉病的发生进行预测预报。基于这个目的，本发明研究监测空气中子囊孢子量的方法和选择性培养基。而目前现有技术没有在病害发生前对子囊孢子进行监测的方法，都是在病害发生后进行病样的分离和培养。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，该选择性培养基中含有毒黄素、恶霉灵、乙磷铝、五氯硝基苯、利福平，使用该培养基可以快速从空气中分离到禾谷镰刀菌复合种，并可解决与其它镰刀菌不易区分、分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题。

本发明筛选药剂的原则是对禾谷镰刀菌复合种抑制率小于10％的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。虽利用已有发明的培养基也可以用来分离空气中镰刀菌，但空气中镰刀菌的种类非常丰富，而造成小麦赤霉病的主要是禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌，用现有技术中已有培养基分离到更多的是非禾谷镰刀菌复合种群。本申请的目的是如何找到一种能够快速鉴别出禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌的分离方法和选择性培养基。

发明人经过大量试验和不懈努力，最终获得了一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，所述选择性培养基为pda培养基中添加毒黄素、恶霉灵、乙磷铝、五氯硝基苯、利福平。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，毒黄素在所述选择性培养基中的浓度为40mg/l-60mg/l、恶霉灵在所述选择性培养基中的浓度5mg/l-20mg/l、乙磷铝在所述选择性培养基中的浓度为50mg/l-100mg/l、五氯硝基苯在所述选择性培养基中的浓度为10mg/l-50mg/l、利福平在所述选择性培养基中的浓度为50mg/l-100mg/l。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，所述选择性培养基可用于分离空气中的禾谷镰刀菌复合种禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)和亚洲镰刀菌(fusariumasiaticum)。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，所述选择性培养基还可分离空气中的镰刀菌属fusariumspp.。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，所述选择性培养基可分离的样本为小麦赤霉病发病田块的空气样品。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基，所述pda培养基组成为：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l，琼脂18g/l，水1l。

优选地，如上所述的一种从空气中分离禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基的使用方法，其特征在于：将选择性培养基放置到小麦冠层上方10cm处，空气中放置约30-60min后，带回实验室在25℃下黑暗培养，1-2天至有菌丝长出；在菌落边缘打取菌饼，置于普通pda培养基上培养，至长出菌落，即得到禾谷镰刀菌复合种。

与现有技术相比，本发明的优点为：

1、实验证明，本发明的选择性培养基具有可行性、准确性高，实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。实验证明，用本发明的选择性培养基可分离空气中镰刀菌，可出现禾谷镰刀菌酒红色特征菌落，解决与其它镰刀菌不易区分，分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题。

2、本发明选择培养基也可用于简便、快捷地从病株组织上或病田土壤中一次性分离尖孢镰刀菌、黄色镰刀菌等镰刀菌病原菌。

3、解决生产实际的问题：小麦赤霉病是一种气传性病害，田间子囊孢子是其最主要的初侵染源，如果能够监测子囊孢子量，则可以对其发生进行预测预报，利用本发明的技术可以为田间监测预警提供技术支持。

附图说明

图1-a为田间玉米秸秆上成熟的子囊果；

图1-b为田间水稻秸秆上成熟的子囊果；

图2为选择性培养基在田间的应用效果。

图3-1为实施例4中的不含毒黄素的pda选择性培养基在田间应用的效果图；

图3-2为实施例4中的不加任何抑制剂的pda培养基在田间应用的效果图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。毒黄素(toxoflavin,98％)购买自sigma中国有限公司，分子式：c7h7n5o2，理化特性：溶于水中，水中溶解度为10mg/ml，在水中白到淡黄色。恶霉灵原药购自山东潍坊天达植保有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是3-羟基-5-甲基异恶唑，通用名称为恶霉灵，分子式：c4h5no2。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为98％。乙磷铝(95％)和五氯硝基苯(95％)购买自阿拉丁官方网上商城。青霉素、利福平、氯霉素均购自北京拓英坊科技有限公司。

在用于田间一次性分离禾谷镰刀菌复合种时，用于禾谷镰刀菌复合种分离培养的杀菌剂组合物中以抑制剂毒黄素和细菌抑制剂利福平为主，加入的其它真菌抑制剂可以用不同的组合，针对不同的大气环境，选择不同的真菌抑制剂。其中，乙磷铝对卵菌有特效，对青霉菌也有较好的抑制作用，因此，对于空气湿度比较大的自然条件下，真菌抑制剂组合可选50-100mg/l乙磷铝，有利于抑制空气中卵菌疫霉和青霉菌。恶霉灵是一种内吸性杀菌剂，对腐霉菌有特效，主要用于环境温度较高时空气中黑根霉的抑制，因此，如在温度较高的中午时分离空气中禾谷镰刀菌复合种，需在上述杀菌剂组合物中添加浓度为5-10mg/l。将上述该含有不同杀菌谱的真菌抑制剂和抗生素类杀细菌剂的杀菌剂组合物添加至pda培养基中，制备成禾谷镰刀菌复合种的选择性培养基。

实施例1、四种真菌抑制剂和三种抗生素对禾谷镰刀菌的抑制作用一、四种真菌抑制剂对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用

用甲醇溶解乙磷铝并配成10⁴mg/l，以氯仿溶解五氯硝基苯配成2000mg/l，用无菌水溶解恶霉灵和毒黄素，分别配制2000mg/l和2.5×10³mg/l的两种药剂母液；其中，将乙磷铝配制系列浓度为50mg/l和100mg/l的含药pda平板；将五氯硝基苯配制系列浓度为10mg/l和50mg/l的含药pda平板；将恶霉灵配制系列浓度为5mg/l、20mg/l、50mg/l和100mg/l的含药pda平板；将毒黄素制剂的母液分别配制系列浓度为40mg/l、60mg/l和100mg/l的含药pda平板，以加有无菌水的平板为对照；然后采用菌生长速率法测定禾谷镰刀菌复合种对乙磷铝、恶霉灵和毒黄素敏感性。将供试的禾谷镰刀菌复合种菌株在pda平板上于25℃预培养3d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有四种药剂系列浓度的pda含药平板中央(浓度含等量有机溶剂)，于25℃下黑暗培养，3-4d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(％)＝[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/(对照菌落增长直径)]×100。

测定了供试的四种真菌抑制剂对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用，结果如表1所示，不同浓度的乙磷铝对禾谷镰刀菌复合种的抑制率为0％，与空白对照不含药的pda培养基无差异。因此可以采用50-100mg/l的乙磷铝作为选择性药剂；50mg/l的五氯硝基苯对禾谷镰刀菌复合种的抑制率为6.7-7.9％，所以采用10-50mg/l作为分离禾谷镰刀菌复合种中使用的选择性药剂；40mg/l的毒黄素对禾谷镰刀菌复合种的抑制率为2.7-3.1％，60mg/l的毒黄素对禾谷镰刀菌复合种的抑制率为5.8-7.6％，所以采用40-60mg/l作为分离禾谷镰刀菌复合种中使用的选择性药剂；20mg/l浓度的恶霉灵对禾谷镰刀菌复合种抑制率为0％，所以可以采用20mg/l作为分离禾谷镰刀菌复合种中使用的选择性药剂。

表1四种真菌抑制剂对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用

二、三种抗生素对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用

用灭菌水将青霉素、利福平、氯霉素三种抗生素均配制成5×10⁴mg/l的母液，再使用三种母液分别配制成浓度为100mg/l、50mg/l的pda含药平板，以加有无菌水的平板为对照。然后采用菌丝生长速率法测定禾谷镰刀菌复合种对这三种抗生素的敏感性。将供试的禾谷镰刀菌复合种在pda平板上于25℃预培养3d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含药剂系列浓度的pda含药平板中央，于25℃下黑暗培养，3-4d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(％)＝[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/(对照菌落增长直径)]×100。

同时测定了不同浓度的三种抗生素对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用，结果见表2，浓度为100或50mg/l的青霉素、利福平和硫酸链霉素对禾谷镰刀菌均没有明显的抑制作用。因此，可以在监测禾谷镰刀菌复合种时使用100mg/l或是50mg/l浓度的青霉素、利福平和硫酸链霉素作为分离纯化禾谷镰刀菌复合种选择性培养基中的抗生素成份。

表2三种抗生素对禾谷镰刀菌复合种的抑制作用

实施例2、三种抗生素对环境中细菌的抑制作用

供试样品：于2019年从武汉市洪山区湖北省农科院植保土肥研究所小麦种植田的大气。

试验方法：此试验是在实施例1结果的基础上检测所选择的三种浓度抗生素是否可有效抑制农田大气中的细菌。对于环境中细菌的检测，主要根据小麦赤霉病的初侵染源主要是来自田间的病残体上释放的子囊孢子以及带病土壤决定的。在赤霉病发病严重的田间放置分别含有50和100mg/l的利福平、青霉素和硫酸链霉素素的平板，以不含药平板为对照，每处理3个重复，2天后观察其对细菌的作用。选择对细菌具有明显抑制作用的抗生素浓度。

本研究在表2结果的基础之上，进一步测定了初步选择可用的三种抗生素对农田大气中细菌的抑制作用。硫酸链霉素抑菌活性差，在其浓度达到100mg/l时，与对照相比，抑菌效果不明显。青霉素、利福平的抑菌活性较强，可以达到抑菌的作用。由于环境中细菌种类的多样性，青霉素主要对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，所以平板中有少许零星革兰氏阴性菌菌落。而对于利福平，50和100mg/l平板都只有少许真菌菌落。因此，利福平对空气中的细菌具有广谱的抑菌作用。

综上所述，本发明筛选药剂的原则是对禾谷镰刀菌复合种抑制率小于10％的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以看出，应用于从空气中一次性分离小麦赤霉菌的选择性培养基，可以选择的真菌抑制剂为毒黄素、恶霉灵、五氯硝基苯和乙磷铝，浓度分别为40-60mg/l、5-20mg/l、10-50mg/l和50-100mg/l；可以选择的抗生素类为利福平，浓度采用50-100mg/l。

实施例3、用于分离禾谷镰刀菌复合种的pda选择性培养基

一、分离方法

2019年在湖北省武汉市洪山区省农科院植保土肥研究所小麦赤霉病抗性鉴定的田块，进行空气中禾谷镰刀菌复合种的分离。分离按下述方法进行：同一地区选择不同的田块进行分离。

分离步骤：将本发明的选择性培养基放置到小麦冠层上方10cm处，空气中放置约30-60min后，带回实验室在25℃下黑暗培养，1-2天至有菌丝长出；在菌落边缘打取菌饼，置于普通pda培养基上培养，至长出菌落，得到禾谷镰刀菌复合种(图2)。对得到的禾谷镰刀菌复合种进行鉴定。将真正的禾谷镰刀菌复合种种保存在pda培养基试管斜面上，加适量的灭菌石蜡油置于室温下保存备用。

二、分离中用到的培养基

选择性培养基ⅰ：向未冷却的pda培养基中添加毒黄素、恶霉灵、乙磷铝、五氯硝基苯和利福平，并用未冷却的pda培养基定容至1升；毒黄素在pda选择培养基i中的浓度为40mg/l，恶霉灵在pda选择培养基i中的浓度为5mg/l，乙磷铝在pda选择培养基i中的浓度为50mg/l，五氯硝基苯在pda选择培养基i中的浓度为10mg/l，利福平在pda选择培养基i中的浓度为50mg/l。

pda选择培养基ii：与pda选择培养基i基本相同，不同之处在于：毒黄素在pda选择培养基i中的浓度为50mg/l，恶霉灵在pda选择培养基i中的浓度为10mg/l，乙磷铝在pda选择培养基i中的浓度为70mg/l，五氯硝基苯在pda选择培养基i中的浓度为20mg/l，利福平在pda选择培养基i中的浓度为70mg/l。

pda选择培养基iii：与pda选择培养基i基本相同，不同之处在于：毒黄素在pda选择培养基i中的浓度为60mg/l，恶霉灵在pda选择培养基i中的浓度为20mg/l，乙磷铝在pda选择培养基i中的浓度为100mg/l，五氯硝基苯在pda选择培养基i中的浓度为50mg/l，利福平在pda选择培养基i中的浓度为100mg/l。

三、分离及鉴定结果

在使用不同的本发明选择培养基进行分离的过程中，pda选择培养基中均没有杂菌长出，只有禾谷镰刀菌复合种能够生长，说明本发明的pda选择培养基抑制了杂菌和腐霉生长，使空气中禾谷镰刀菌复合种的分离更容易。本发明方法从开始放置空气中至选择性培养基上至有特征酒红色的禾谷镰刀菌复合种菌丝长出，一般只需要1-2天，本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生长，使禾谷镰刀菌复合种在培养基中成为优势菌群，生长速度提高，从而加快了分离进程。

实施例4、用于分离禾谷镰刀菌复合种的pda选择性培养基

一、分离方法

同实施例3中的方法。

二、分离中用到的培养基：两种培养基：①与实施例3中的培养基中成分相同，仅去掉毒黄素的成分，②不含有任何选择性成分的常规pda培养基；

三、分离及鉴定结果

结果发现，采用不含毒黄素的选择性培养基，也可以分离到较纯的菌落，但没有出现酒红色特征颜色的菌落，进而无法判断是否是要的镰刀菌复合种(见图3-1)，还需要进行常规形态学鉴定或是采用分子鉴定。不含有选择性成分的常规pda培养基，含有很多的杂菌，主要包括根霉菌，曲霉菌以及细菌等，结果见图3-2。