利用海鞘桔青霉Asc2-4制备同时富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法与流程

本发明属于生物提取技术领域。更具体地，涉及一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备同时富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法。

背景技术：

微生物油脂是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物利用外源营养物质合成并储存在细胞内的油脂。海洋相较于陆地具有高盐、高压和低氧的极端特点，形成海洋真菌特有的产油性质。

产油真菌普遍能够利用多种碳源生长菌体和积累油脂。碳源的种类和浓度对产油真菌的油脂含量和不饱和组分具有影响。hen等研究t.fermentans利用纯甘油进行发酵产油，生物量、油脂产量和油脂含量分别为4.0g/l、1.4g/l和35.0％。另外，氮源对不同真菌的影响也不同，而且即使针对同一产油真菌，氮源的组成和浓度不同对生物量和油脂产率的影响也各不一样。马治灿发现产油镰刀霉的最适单一氮源为硝酸钾，过高的碳氮比不利于生物量的提高，过低的碳氮比容易使发酵天数延长。再者，金属离子能够对产油微生物的菌体生长、胞内外渗透压和酶活力产生作用，从而影响产油微生物的油脂合成能力，因此即使针对同一种产油真菌，不同金属离子的组成和浓度不同对产油真菌的生物量和油脂产率的也不一样。崔振阳以皮状丝孢酵母为研究对象，在发酵培养基中加入4.0g/l的cacl2发现其油脂产量无明显影响，但可以促进其底物的转化率。薛汉明等发现fe³⁺对三角褐指藻的去不饱和酶活性的有促进作用。此外，转速及装液量决定培养基的溶氧条件，对菌体生长和产油量具有影响。钟琦等发现70ml/250ml空气量对油脂酵母eam-ac16的生物量比油脂产量影响程度大。

海鞘是一种海洋生物，属脊索动物门、尾索动物亚门、海鞘纲，在天然海区附着珍珠贝笼上生长。研究表明，海洋无脊椎动物共附生微生物平均每种动物达数百种，其密度高者占宿主动物总重量的40％，多数属于难培养的微生物范畴。海鞘是营固着生活的动物，体外被一层类似植物纤维素的被囊象鞘一样套着，是动物界独一无二的。海鞘独特的摄食、滤食系统使其体内、体表富集了大量的微生物。与陆地微生物相比，海鞘共附生真菌能够耐受海洋特有的高盐、高压、低氧、低光照等多种极端条件，因此形成了独特的代谢和生理特性，产生了不同化学结构的代谢产物，为人类提供了陆地微生物所不能提供的活性代谢产物。这些活性物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、凝血和溶血等生物活性，成为开发海洋药物资源的重要内容之一。

中国专利文献cn106047956a公开了一种利用海鞘共附生桔青霉asc2-4发酵制备富含γ-亚麻酸的油脂的方法。该方法制备的油脂仅富含不饱和脂肪酸油脂，所得油脂中不饱和脂肪酸γ-亚麻酸油脂含量较高。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备同时富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法。

本发明的目的是提供海鞘桔青霉菌asc2-4在制备同时富含饱和与不饱和脂肪酸油脂方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备富含饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的油脂的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

海鞘桔青霉菌asc2-4在制备同时富含饱和与不饱和脂肪酸油脂方面的应用。所述饱和脂肪酸油脂是指硬脂酸和棕榈酸。

一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法，包括以下步骤：

s1.将海鞘桔青霉asc2-4接种于种子培养基进行摇床培养；

s2.将培养后的种子接种于发酵培养基，在装液量为培养容器体积的40％～80％、转速为120～280rpm的条件下进行发酵，获得桔青霉菌丝体，然后从菌丝体中提取富含饱和与不饱和脂肪酸油脂；

所述发酵培养基的组成为：碳源50～150g/l、土豆150～200g/l、柠檬酸钠0.1～0.5g/l、海精盐10～20g/l、氮源0.1～1.5g/l、kh2po42～6g/l、mgso450～150mg/l、fecl32～6μg/l；

所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、乳糖或蔗糖中的一种或几种；

所述氮源为酵母膏与蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素或牛肉膏的混合物；

碳氮比为40～120；

所述海鞘桔青霉菌asc2-4于2016年7月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60059。

在其中一优选例，所述碳源为葡萄糖；所述碳源的浓度为100～125g/l。

在其中一优选例，所述氮源为酵母膏与蛋白胨的混合物；酵母膏与蛋白胨的质量比为1：1。

在其中一优选例，所述碳氮比为100。

在其中一优选例，所述发酵培养基的组成最优为：葡萄糖100g/l、土豆200g/l、柠檬酸钠0.1g/l、海精盐15g/l、蛋白胨0.5g/l、酵母膏0.5g/l、kh2po44g/l、mgso4150mg/l、fecl32.0μg/l。

在其中一优选例，所述装液量为培养容器体积的40％，所述转速为220rpm。

在其中一优选例，所述种子培养基的组成为：马铃薯浸出粉6～10g/l、葡萄糖18～22g/l、海精盐13～17g/l、硫酸铵8～12g/l。在其中一优选例，所述种子培养基的组成更优选为：马铃薯浸出粉8g/l、葡萄糖20g/l、海精盐15g/l、硫酸铵10g/l。

在其中一优选例，s1的培养条件为26～28℃、180～200rpm培养2～3d。

在其中一优选例，s2的培养温度为26～28℃，培养时间为5～7d。

在其中一优选例，从菌丝体中提取富含饱和与不饱和油脂的方法是酸热法，具体步骤如下：菌丝体培养结束后，进行固液分离，然后将菌丝体烘干，得到干菌体，进行粉碎破壁处理；然后添加盐酸，室温放置，再于沸水浴加热后，速冷，重复2～3次；最后加入氯仿-甲醇混合液，充分振荡后离心，挥发除去氯仿即得油脂。

在其中一优选例，所述干菌体和盐酸的质量体积比为1～1.5g：5.5～6ml，所述盐酸的浓度为4～4.5mol/l。

在其中一优选例，所述室温放置的时间为30～35min；所述沸水浴加热的时间为9～12min。

在其中一优选例，所述氯仿-甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1.5～2.5：0.8～1.2。

在其中一优选例，所述饱和脂肪酸包括硬脂酸和棕榈酸，所述不饱和脂肪酸包括油酸和亚油酸；所得油脂中饱和脂肪酸的含量为46％～50％，不饱和脂肪酸的含量为50％～54％。

在其中一优选例，油酸含量占总油脂质量的25％～27％，占不饱和脂肪酸质量的46％～54％；亚油酸含量占总油脂质量的25％～27％，占不饱和脂肪酸质量的46％～54％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过海鞘桔青霉asc2-4的培养基优化，使生物量和油脂浓度，分别从7.35g/l和0.40g/l提高至14.47g/l和4.43g/l，分别提高了约1倍和10倍。

(2)本发明通过设置不同溶氧条件确定适宜的转速和装液量，优化后的生物量和油脂浓度进一步提高至19.90g/l和8.76g/l，分别提高了约0.3倍和1倍。

(3)本发明通过海鞘桔青霉asc2-4的培养基和培养条件优化，从海鞘桔青霉asc2-4发酵制备出同时富含饱和与不饱和脂肪酸的油脂，含量最高的四种脂肪酸依次为：亚油酸＞硬脂酸＞油酸＞棕榈酸，其中功能价值较高的油酸和亚油酸含量占总油脂质量的25％～27％，占不饱和脂肪酸质量的46％～54％。本发明利用海鞘桔青霉asc2-4能够生产出富含油酸和亚油酸的功能性油脂。

附图说明

图1是五种单一碳源对生物量和油脂浓度的影响。

图2是不同葡萄糖浓度对生物量和油脂浓度的影响。

图3是五种氮源对生物量和油脂浓度的影响。

图4是不同碳氮比对生物量和油脂浓度的影响。

图5是均值主效应图。

图6是不同溶氧条件下对桔青霉asc2-4的生物量及油脂浓度的影响；其中a图为不同溶氧条件对生物量的影响；b图为不同溶氧条件对油脂浓度的影响。

图7是桔青霉asc2-4油脂的气相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

(1)仪器与设备

hzq-f160振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；bmj-25型霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ls-b50l立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；gc-2010plus气相色谱仪，日本岛津公司。

(2)菌株

菌株：海鞘桔青霉菌asc2-4(penicilliumcitrinumasc2-4)，分离自广东省雷州市流沙虾塘的海鞘，保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号gdmccno：60059。

实施例1方法优化

1、方法

(1)种子培养与发酵

种子培养：挑取海鞘桔青霉菌asc2-4(分离自广东省雷州市流沙虾塘的海鞘，保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号gdmccno：60059)单菌落接种于装有200ml种子培养基的500ml的锥形瓶中，在28℃、180rpm的摇床中培养2d。种子培养基的组成为：马铃薯浸出粉8g/l、葡萄糖20g/l、海精盐15g/l、硫酸铵10g/l。

摇床发酵培养：将培养后的种子液按5％接种于含发酵培养基的250ml锥形瓶中，在28℃的摇床中发酵7d。初始发酵培养基的组成为：葡萄糖120g/l、土豆200g/l、柠檬酸钠0.1g/l、磷酸氢二钾0.2g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、酵母膏0.5g/l、硫酸铵2g/l、海精盐15g/l。

(2)碳氮源单因素优化

碳源：单一碳源优化包括葡萄糖、麦芽糖、甘油、乳糖和蔗糖。

碳源浓度：将碳源浓度设置成50g/l、75g/l、100g/l、125g/l、150g/l进行优化。

氮源：将蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素和牛肉膏，与酵母膏按质量比为1：1的比例添加并优化。

碳氮比：在碳源浓度一定的条件下，通过添加不同浓度的氮源，按碳氮比40、60、80、100、120优化。

每组实验做三个平行，结果取平均值。

(3)无机盐优化

对8种无机盐，分别为mgso4、cacl2、kh2po4、nah2po4、k2hpo4、fecl3、znso4和cocl2。按三种浓度添加与不加无机盐进行比较，将三种明显提高产油量的无机盐进行正交试验得出最优的组合。对明显刺激油脂积累的无机盐进行三因素三水平正交试验l9(3³)(表1)。每组实验做三个平行，结果取平均值。

表1因素水平表

(4)溶氧条件设置

将摇床转速120rpm、180rpm、220rpm和280rpm分别与250ml锥型瓶的装液量100ml、150ml和200ml组合设置成12组不同溶氧条件，通过摇床发酵最终确定适宜的转速与装液量。

2、评价指标

(1)生物量

生物量采用细胞干重法，发酵后的菌丝通过真空抽滤得到，将菌丝置于温度为109℃的烘箱中烘干，恒重后称重。

生物量计算：

(2)油脂浓度及油脂百分含量

酸热法提取油脂：按每1.00g的干菌体添加4.00mol/l的盐酸6.00ml的方法提取总油脂，室温下放置30min后，沸水浴加热10min，-20℃速冻，重复2到3次后，加入2倍体积的氯仿甲醇(2：1，v/v)混合液，充分振荡后，在2000r/min条件下离心15min，挥发除去氯仿甲醇即得油脂。

油脂浓度的计算：

油脂百分含量的计算：

(3)脂肪酸组分

样品甲酯化，利用气相色谱仪进行脂肪酸组分分析。

气相色谱条件：sp-2560气相毛细管柱(100×0.25×0.2)；检测器为氢火焰离子检测器(fid)；进样口温度225℃；检测器温度250℃；分流比10：1。

程序升温条件：柱温100℃，维持13min，以10℃/min升至180℃，维持6min，再以1℃/min升至200℃，维持20min，再以4℃/min升至235℃，维持20min。

3、结果

(1)发酵培养基碳氮源优化

1)碳源优化

由图1可知，桔青霉asc2-4能够利用此五种碳源合成油脂。蔗糖、麦芽糖和甘油的生物量和油脂浓度相近，分别为5.65g/l和0.32g/l；5.00g/l和0.35g/l；5.78g/l和0.25g/l，可知该菌对这三种碳源的利用能力相近。桔青霉asc2-4对乳糖的利用效率最低，可知乳糖不适宜作为碳源。葡萄糖作为碳源该菌的生物量和油脂浓度最高，分别达到7.35g/l和0.40g/l，确定葡萄糖为最适单一碳源。

2)碳源浓度优化

由图2可知，桔青霉asc2-4在葡萄糖浓度为50～100g/l的范围内，生物量逐渐递增，而油脂浓度呈现先降低后升高。从100～150g/l葡萄糖浓度下，生物量和油脂浓度出现下降很可能是因为受到过高的葡萄糖浓度对菌体生长与油脂积累出现抑制。葡萄糖浓度125g/l与100g/l的生物量相对较高。100g/l的葡萄糖浓度生物量和油脂浓度皆达到最高，分别为8.33g/l和0.56g/l(图2)，因此，最适葡萄糖浓度为100g/l。

3)氮源优化

由图3可知，将五种氮源分别与酵母膏按1:1添加的方法进行优化。由图3可知，对于无机氮源而言，硫酸铵比硝酸钾更利于菌体生长和积累油脂，可知该菌利用氨基氮源比利用硝基氮源的效率高。对于有机氮源为蛋白胨时，桔青霉asc2-4的生物量和油脂浓度都达到最高，分别为8.78g/l和2.71g/l，蛋白胨为桔青霉asc2-4的最适氮源(图3)。在牛肉膏和尿素这两种有机氮源的生物量与油脂含量均低于蛋白胨。将硫酸铵和蛋白胨作为氮源，该菌的生物量分别为8.25g/l和8.58g/l，而油脂浓度分别为0.46g/l和0.75g/l，因此，蛋白胨+酵母膏(质量比为1：1)为最适氮源。

4)碳氮比优化

由图4可知，桔青霉asc2-4在碳氮比(40～120)条件下培养，碳氮比在40～80的范围内，生物量呈下降趋势，而油脂浓度逐渐升高，这可能是因为氮源缺少影响菌体生长，菌体因氮源含量逐渐降低，而更快进入油脂积累阶段，从而提高油脂积累量。碳氮比100时，生物量和油脂浓度均达到最高，分别为11.59g/l和2.71g/l(图4)，这表明该菌在高碳氮比的条件下更有利于油脂合成。120的碳氮比造成油脂浓度下降，可能是因为氮源不足限制了菌丝生长，从而油脂合成受到抑制。

(2)培养基无机盐优化

1)不同无机盐对桔青霉asc2-4生长及产油的影响

表2不同种类无机盐对生物量和油脂浓度的影响

由表2可知，适量添加cacl2能提高生物量，但对菌体产油有抑制作用，其油脂浓度降低5％。k2hpo4对菌体生长和产油既不促进也不抑制。适宜浓度的znso4能提高生物量，但不促进油脂积累。适宜添加nah2po4和cocl2能促进菌体生长，且油脂浓度分别提高2％和3％。其中，该菌受mgso4和kh2po4刺激提升油脂浓度的幅度较大，分别约提高30％和28％。桔青霉asc2-4适量添加适宜浓度的fe³⁺能大幅提高33％的油脂浓度。综上可知，油脂浓度促进作用明显的无机盐为mgso4、kh2po4和fecl3，因此选用此三种无机盐做进一步的正交优化。

2)正交试验

表3无机盐正交试验对油脂浓度的影响

正交试验极差分析结果如表3，kh2po4、mgso4和fecl3三种无机盐的三个最高水平的数据均值分别为a2、b3、c1，所以无机盐添加量的最佳浓度为a2b3c1，即kh2po44.0g/l、mgso4150.0mg/l、fecl32.0μg/l，且影响因素c＞a＞b，fecl3对菌株发酵产油脂的影响最大(图5)。无机盐浓度配比为：kh2po44g/l、mgso4150mg/l、fecl32.0μg/l，经无机盐优化后油脂浓度达到4.63g/l，提高了41％。

(3)溶氧条件优化

由图6可知，100～200ml的装液量在各转速条件中，皆呈现下降趋势，说明该菌在低装液量(100ml)有利于生物量增长和油脂积累。当溶氧条件为180rpm、100ml和180rpm、150ml时，生物量较高，分别达到20.39g/l和20.62g/l，这可能是因为该条件下的液体剪切力对菌体增长更适宜。在280rpm高转速条件下，生物量在11.79～17.44g/l之间，这说明桔青霉asc2-4具有较高的抗液体剪切力能力，该特性对工业产油具有重要意义。在100ml220rpm条件下，生物量为19.90g/l，油脂浓度和油脂百分含量最高8.76g/l和44％(图6)，可知100ml装液量和220rpm转速为适宜的溶氧条件。

(4)桔青霉asc2-4脂肪酸组分分析

将优化后的桔青霉asc2-4油脂进行脂肪酸气相色谱法分析。结果如图7和表4。

表4桔青霉asc2-4油脂的脂肪酸各组分百分含量

由图7和表4可知，桔青霉asc2-4油脂主要为c16和c18系脂肪酸，含量最高的四种脂肪酸依次为：亚油酸＞硬脂酸＞油酸＞棕榈酸，其中功能价值较高的脂肪酸为油酸(c18：1)和亚油酸(c18：2)，含量分别为26.05％和26.67％，该两种脂肪酸的总百分含量达52.72％。由此可知，桔青霉asc2-4能够用于生产油酸和亚油酸功能性油脂。

有上述结果可知，适宜桔青霉asc2-4生长及产油的最佳发酵培养基配方组成为：葡萄糖100g/l，土豆200g/l，柠檬酸钠0.1g/l，海精盐15g/l，葡萄糖100g/l，蛋白胨0.5g/l，酵母膏0.5g/l，kh2po44g/l，mgso4150mg/l，fecl32.0μg/l。

通过海鞘桔青霉asc2-4的培养基优化，使生物量和油脂浓度，分别从7.35g/l和0.40g/l提高至14.47g/l和4.43g/l，分别提高了约1倍和10倍。

通过设置不同溶氧条件确定适宜的转速和装液量，分别为220rpm和100ml，优化后的生物量和油脂浓度进一步提高至19.90g/l和8.76g/l，分别提高了约0.3倍和1倍。

由脂肪酸组分分析可知，不饱和脂肪酸含量达53.37％，其中油酸、亚油酸含量达到26％以上，可见桔青霉asc2-4可作为生产油酸和亚油酸功能性油脂的菌株。

实施例2

一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法，包括以下步骤：

s1.将海鞘桔青霉asc2-4接种于种子培养基，在26℃、200rpm的摇床中培养3d；该种子培养基的组成为：马铃薯浸出粉8g/l、葡萄糖20g/l、海精盐15g/l、硫酸铵10g/l；

s2.将培养后的种子接种于发酵培养基，在装液量为培养容器体积的40％、转速为220rpm的条件下，在26℃的摇床中发酵5d，获得桔青霉菌丝体，该发酵培养基的组成为：葡萄糖100g/l、土豆200g/l、柠檬酸钠0.1g/l、海精盐15g/l、蛋白胨0.5g/l、酵母膏0.5g/l、kh2po44g/l、mgso4150mg/l、fecl32.0μg/l；酵母膏与蛋白胨的质量比为1：1；

s3.酸热法提取油脂：按每1.00g的干菌体添加4.00mol/l的盐酸6.00ml的方法提取总油脂，室温下放置30min后，沸水浴加热10min，-20℃速冻，重复2到3次后，加入2倍体积的氯仿甲醇(2：1，v/v)混合液，充分振荡后，在2000r/min条件下离心15min，挥发除去氯仿甲醇即得富含饱和与不饱和脂肪酸的油脂。

实施例3

一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法，包括以下步骤：

s1.将海鞘桔青霉asc2-4接种于种子培养基，在28℃、180rpm的摇床中培养2d；该种子培养基的组成为：马铃薯浸出粉6g/l、葡萄糖18g/l、海精盐13g/l、硫酸铵8g/l；

s2.将培养后的种子接种于发酵培养基，在装液量为培养容器体积的40％、转速为180rpm的条件下，在28℃的摇床中发酵5d，获得桔青霉菌丝体，该发酵培养基的组成为：葡萄糖50g/l、土豆150g/l、柠檬酸钠0.1g/l、海精盐10g/l、蛋白胨0.1g/l、酵母膏0.1g/l、kh2po42g/l、mgso450mg/l、fecl32.0μg/l；酵母膏与蛋白胨的质量比为1：1；

s3.酸热法提取油脂：按每1.00g的干菌体添加4.00mol/l的盐酸6.00ml的方法提取总油脂，室温下放置30min后，沸水浴加热10min，-20℃速冻，重复2到3次后，加入2倍体积的氯仿甲醇(2：1，v/v)混合液，充分振荡后，在2000r/min条件下离心15min，挥发除去氯仿甲醇即得富含饱和与不饱和脂肪酸的油脂。

实施例4

一种利用海鞘桔青霉asc2-4制备富含饱和与不饱和脂肪酸油脂的方法，包括以下步骤：

s1.将海鞘桔青霉asc2-4接种于种子培养基，在28℃、180rpm的摇床中培养2d；该种子培养基的组成为：马铃薯浸出粉6g/l、葡萄糖18g/l、海精盐13g/l、硫酸铵8g/l；

s2.将培养后的种子接种于发酵培养基，在装液量为培养容器体积的80％、转速为180rpm的条件下，在26℃的摇床中发酵3d，获得桔青霉菌丝体，该发酵培养基的组成为：葡萄糖150g/l、土豆200g/l、柠檬酸钠0.5g/l、海精盐20g/l、蛋白胨1.5g/l、酵母膏1.5g/l、kh2po46g/l、mgso4150mg/l、fecl36μg/l；酵母膏与蛋白胨的质量比为1：1；

s3.酸热法提取油脂：按每1.00g的干菌体添加4.00mol/l的盐酸6.00ml的方法提取总油脂，室温下放置30min后，沸水浴加热10min，-20℃速冻，重复2到3次后，加入2倍体积的氯仿甲醇(2：1，v/v)混合液，充分振荡后，在2000r/min条件下离心15min，挥发除去氯仿甲醇即得富含饱和与不饱和脂肪酸的油脂。

同等条件下进行测试，实施例2、3和4相比，实施例2所得饱和脂肪酸油脂、不饱和脂肪酸油脂的含量均最高。所得油脂中饱和脂肪酸的含量为46％，不饱和脂肪酸的含量为54％。油酸含量占总油脂质量的27％，占不饱和脂肪酸质量的50％；亚油酸含量占总油脂质量的27％，占不饱和脂肪酸质量的50％。

申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。