香蕉转录因子MaARF12、MaARF24及其在抑制MaSBE2.3表达上的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及香蕉转录因子maarf12、maarf24及其在抑制masbe2.3表达上的应用。

背景技术：

植物淀粉是人类营养和能量的主要来源，由直链淀粉和支链淀粉两部分组成，而支链淀粉约占总淀粉含量的70-80％，是影响淀粉品质及加工性能的关键因子(银永安等,2018)。支链淀粉生物合成主要由可溶性淀粉合成酶(solublestarchsynthase,ss)、淀粉分支酶(starchbranchingenzyme,sbe)和淀粉脱分支酶(dbe)三种酶所决定(myersetal.,2000)。sbe主要控制支链淀粉分支模式，并最终影响淀粉品质、产量及其营养价值(kimetal.,1999；tetlowetal.,2014)。同时，sbe基因表达涉及植物生长、发育及成熟等多个生物过程(chenetal.,2017；panetal.,2018)，且sbe基因表达受一系列转录因子调控，如水稻osbzip58转录因子能够与ossbe1启动子区结合，并调控其上调表达(wangetal.,2018)。玉米zmsbe基因表达在胚乳特异转录因子opaque2(o2)和prolamin-boxbindingfactor(pbf)突变体中被抑制。

生长素响应因子(auxinresponsefactor,arf)作为一类调控植物生长发育与信号转导的重要转录因子(hagenetal.,2002)，能够激活或抑制受生长素快速诱导的靶基因aux/iaa、saur和gh3表达(liscumetal.,2002；hagenetal.,2002)。然而，arf是否能够与sbe基因互作并调控其表达，目前还未见报道。因此，开展转录因子maarf12或maarf24与香蕉masbe2.3基因互作及表达调控机制研究是全新的。同时，对改善支链淀粉合成代谢、淀粉品质及培育优质香蕉新品种具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供可抑制香蕉果实淀粉分支酶基因sbe2.3表达的香蕉转录因子maarf12、maarf24及其编码基因和应用。

本发明的第一个方面是提供一种香蕉转录因子，其为由核苷酸序列如seqidno:1所示的基因编码的香蕉转录因子maarf12、或者为由核苷酸序列如seqidno:2所示的基因编码的香蕉转录因子maarf24。

本发明的第二个方面是提供一种香蕉转录因子基因，其为香蕉转录因子maarf12基因，核苷酸序列如seqidno:1所示，或者其为香蕉转录因子maarf24基因，核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第二个方面所述的香蕉转录因子基因。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pgreenii62sk载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pgreenii62sk载体质粒，seqidno:1或seqidno:2所示核苷酸序列位于pgreenii62sk载体质粒的saci和ecori两种限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的香蕉转录因子、或者本发明第二个方面所述的香蕉转录因子基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体在抑制香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3表达中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子，其核苷酸序列如seqidno:7所示。

本发明的第六个方面是提供另一种重组载体，其包含原始载体和本发明第五个方面所述的香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pgreenii0800载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pgreenii0800载体质粒，seqidno:7所示核苷酸序列位于pgreenii0800载体质粒的xhoi和smai两种限制性内切酶位点之间。

本发明的第七个方面是提供如本发明第五个方面所述的香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子、或者本发明第六个方面所述的重组载体在抑制香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3表达中的应用。

其中，本发明第五个方面所述的香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子与本发明第一个方面所述的香蕉转录因子互作，从而抑制香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3表达。

本发明的第八个方面是提供一种用于扩增香蕉转录因子maarf12基因的引物对，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

本发明的第九个方面是提供一种用于扩增香蕉转录因子maarf24基因的引物对，其核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示。

本发明的第十个方面是提供一种用于扩增香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子，其核苷酸序列如seqidno:8和seqidno:9所示。

本发明的香蕉转录因子maarf12和香蕉转录因子maarf24能够与香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子区结合，能够与masbe2.3基因互作，且抑制其表达，例如将香蕉转录因子maarf12基因或香蕉转录因子maarf24基因和香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子共同导入香蕉果实中，可以显著抑制香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3的表达，这对调控支链淀粉含量、改善淀粉品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义，为改良香蕉或其他果实支链淀粉品质提供了候选香蕉转录因子资源。

附图说明

图1为pabai-masbe2.3promoter双酶切验证电泳结果图，m：dl2000dnamarker；泳道1：为pabai-masbe2.3promoter重组质粒双酶切结果。

图2为masbe2.3基因启动子自激活及其maarf12和maarf24酵母单杂交验证结果，a：masbe2.3基因启动子自激活实验；b：maarf12及maarf24分别与masbe2.3基因启动子酵母单杂交互作验证。p53promoter：阳性对照启动子；masbe2.3promoter：masbe2.3基因启动子；ad-rec-p53+p53promoter：阳性对照组合；ad+empty+masbe2.3promoter：阴性对照组合，maarf12+masbe2.3promoter：转录因子maarf12和masbe2.3基因启动子互作验证；maarf24+masbe2.3promoter：转录因子maarf24和masbe2.3基因启动子互作验证。

图3为pgreenii62sk-arf12双酶切验证电泳结果图，m：dl2000dnamarker；泳道2：pgreenii62sk-arf12重组质粒双酶切结果。

图4为pgreenii62sk-arf24双酶切验证电泳结果图，m：dl2000dnamarker；泳道3：pgreenii62sk-arf24重组质粒双酶切结果。

图5为pgreenii0800-masbe2.3promoter双酶切验证电泳结果图，m：dl2000dnamarker；泳道1：为pgreenii0800-masbe2.3promoter重组质粒双酶切结果。

图6为pgreenii0800-masbe2.3promoter和pgreenii62sk-maarf12及pgreenii62sk-maarf24载体构建模式图和luc活性检测，a：pgreenii0800-masbe2.3promoter、pgreenii62sk-maarf12及pgreenii62sk-maarf24载体构建模式图；b：luc活性检测结果；sk：pgreenii62sk载体；sk+maarf12：pgreenii62sk-maarf12载体；sk+maarf24：pgreenii62sk-maarf24载体。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、基因获得

1、香蕉转录因子maarf12基因的获得

以巴西蕉果实cdna为模板，以

5’-atgaagctttccactgttggtatc-3’

5’-ctaacagaaagagtcaactccct-3’

为引物，通过pcr方法扩增获得的一种含有碱基序列为2,406bp，其序列如seqidno.1所示。

2、香蕉转录因子maarf24基因的获得

以巴西蕉果实cdna为模板，以

5’-atggcgtcgtcggaggtgtcggt-3’

5’-tcaaaaggccgcatcaactccag-3’

为引物，通过pcr方法扩增获得的一种含有碱基序列为2,625bp，其序列如seqidno.2所示。

3、香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子的获得

以巴西蕉果实dna为模板，以

5’-aggttctatatacttaattactc-3’

5’-tcgtatggagctgaggcgggtgatc-3’

为引物，通过pcr方法扩增获得的一种含有碱基序列为1,824bp，其序列如seqidno.7所示。

二、酵母单杂交

(1)酵母单杂交文库的构建与筛选

应用rna提取试剂盒(tiangenbiotech)提取巴西蕉抽蕾后0d、20d和80d的果肉总rna，然后通过mathchmakertm酵母单杂交试剂盒(clontech,mountainview,ca)构建cdna文库，并装载于猎物载体pgadt7-rec(clontech)上。masbe2.3启动子(1,824bp)质粒经saci和xhoi双酶切、回收、连接，构建于诱饵载体pabai(clontech)(图1)上。将携带cdna文库的pgadt7-rec猎物载体和携带masbe2.3启动子序列的pabai诱饵载体共转化y1hgold酵母菌株(clontech)，在sd/-leu+aba²⁰⁰筛选培养基上30℃培养3d。通过pcr检测、测序分析以及香蕉a基因组数据库比对注释，获得候选转录因子maarf12和maarf24。

(2)masbe2.3启动子自激活实验及其与maarf12和maarf24互作验证

为进一步验证masbe2.3启动子与maarf12和maarf24互作，masbe2.3启动子自激活活性在sd/-ura+aba²⁰⁰培养基上被验证，见图2a，在选择培养基sd/-ura+aba²⁰⁰上，pabai-masbe2.3promoter菌株不能生长，说明masbe2.3启动子没有自激活活性。通过构建转录因子maarf12和maarf24基因于猎物载体pgadt7ad上，masbe2.3启动子于诱饵载体pabai上，然后共转化酵母菌株y1hgold(clontech)，在sd/-leu+aba²⁰⁰筛选培养基上于30℃培养3d，见图2b，在筛选培养基sd/-leu+aba²⁰⁰上，pgadt7ad-maarf12+pabai-masbe2.3promoter菌株或pgadt7ad-maarf24+pabai-masbe2.3promoter菌株均能够正常生长，说明maarf12和maarf24能够与masbe2.3启动子互作。

三、重组载体的构建

1、pgreenii62sk-maarf12载体

将上述香蕉转录因子maarf12基因的核苷酸序列，利用saci和ecori分别对目的片段及pgreenii62sk载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与pgreenii62sk载体片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉转录因子maarf12基因的pgreenii62sk-maarf12载体(图3)。

2、pgreenii62sk-maarf24载体

将上述香蕉转录因子maarf24基因的核苷酸序列，利用saci和ecori分别对目的片段及pgreenii62sk载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与pgreenii62sk载体片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉转录因子maarf24基因的pgreenii62sk-maarf24载体(图4)。

3、pgreenii0800-masbe2.3promoter载体

将上述香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子的核苷酸序列，利用xhoi和smai两种限制性内切酶分别对目的片段及pgreenii0800载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与pgreenii0800载体片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子的载体pgreenii0800-masbe2.3promoter(图5)。

四、重组载体转化至香蕉果实薄片及双荧光素酶活性检测方法

(1)pgreenii0800-masbe2.3promoter载体的农杆菌转化

取200μl冰浴上融化的根癌农杆菌gv3101感受态细胞，加入pgreenii0800-masbe2.3promoter重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μlyep液体培养基，28℃，250rpm预培养4-5h；吸取300μl菌液至含有25mg/lrif和50mg/lkan的yep固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2-3d，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。

(2)pgreenii62sk-maarf12载体的农杆菌转化

取200μl冰浴上融化的根癌农杆菌gv3101感受态细胞，加入pgreenii62sk-maarf12重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μlyep液体培养基，28℃，250rpm预培养4-5h；吸取300μl菌液至含有25mg/lrif和50mg/lkan的yep固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2-3d，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。

(3)pgreenii62sk-maarf24载体的农杆菌转化

取200μl冰浴上融化的根癌农杆菌gv3101感受态细胞，加入pgreenii62sk-maarf24重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μlyep液体培养基，28℃，250rpm预培养4-5h；吸取300μl菌液至含有25mg/lrif和50mg/lkan的yep固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2-3d，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。

(4)根癌农杆菌介导香蕉果实薄片遗传转化

在超净工作台上将香蕉果实薄片(厚度1mm)浸泡于5ml75％乙醇的无菌离心管中1min，浸泡期间充分晃动，然后用无菌水冲洗3次；20％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡期间充分晃动，用无菌水冲洗3次。将已经转化pgreenii0800-masbe2.3promoter重组载体的根癌农杆菌gv3101菌液与已经转化pgreenii62sk-maarf12重组载体或pgreenii62sk-maarf24重组载体的根癌农杆菌gv3101菌液按照1:7的体积比加入到10ml含有25mg/lrif和50mg/lkan的yep液体培养基中过夜活化培养；吸取活化培养的菌液1ml到新的50ml含有25mg/lrif和50mg/lkan的yep液体培养基中培养至od600＝0.6；将所需浓度的菌液于超净工作台上转移到50ml无菌离心管中，4℃，6000rpm离心5min，弃去上清液，加入等体积(离心前菌液体积)的ms液体培养基将菌体重新悬浮；将菌液转移到100ml无菌三角瓶中，加入0.1％体积(重悬菌液体积)的乙酰丁香酮(as)，充分混匀，然后将香蕉果实薄片转移至农杆菌菌液中浸泡15min，期间摇动菌液使果实薄片于菌液充分接触；将薄片取出置于无菌滤纸上，吸干薄片表面多余的菌液，然后将其转移到含有乙酰丁香酮的ms培养基上，25℃培养3d；将共培养的香蕉果实薄片用于双荧光素酶活性检测。

(5)双荧光素酶活性检测方法

应用dual-lucreporter分析系统检测上述香蕉果实薄片中海肾荧光素酶-萤火虫荧光素酶(ren-luc)活性，实验重复三次。首先在冰上研磨香蕉果实薄片呈浆，等体积加入细胞裂解液，充分混匀。冰上孵育5min，充分裂解细胞。13000rpm离心1min，取上清。取20μl细胞裂解液，加至黑色酶标板中，设置3孔重复。配制luc反应液和ren反应液，即luc底物(50x)和ren底物(50x)分别用对应的缓冲液稀释至1倍工作液。并孵育至室温。加入100μlluc反应液，震板混匀，检测luc活力，检测尽量在30min内完成。加入100μlren反应液，震板混匀，检测ren活力，检测尽量在30min内完成。计算luc/ren比值，得到相对luc活性(图6)。在maarf12和masbe2.3promoter同时存在的条件下，与对照相比较，luc活性下降约4.0倍，说明maarf12抑制了masbe2.3基因表达活性。在maarf24和masbe2.3promoter同时存在的条件下，与对照相比较，luc活性下降约0.8倍，说明maarf24抑制了masbe2.3基因表达活性。

本发明基于酵母单杂交实验发现转录因子maarf12和maarf24能够与香蕉果实淀粉分支酶基因masbe2.3启动子区结合。通过构建pgreenii0800-masbe2.3promoter、pgreenii62sk-maarf12及pgreenii62sk-maarf24载体，在香蕉果实薄片中分别共表达maarf12-masbe2.3promoter和maarf24-masbe2.3promoter两种组合，双荧光素酶活性检测发现maarf12和maarf24均下调masbe2.3基因表达。这些结果显示，maarf12和maarf24均能够与masbe2.3基因互作，且抑制其表达，为改良香蕉或其他植物支链淀粉品质提供了候选转录因子资源。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>香蕉转录因子maarf12、maarf24及其在抑制masbe2.3表达上的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2406

<212>dna

<213>artificial

<400>1

atgaagctttccactgtaggtatcagccagcatgcaccggaagaggaggagaagagatgt60

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<211>2625

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