烟草多酚氧化酶基因NtPPO2a和/或NtPPO2b在抗旱烟草品种选育中的应用的制作方法

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b在抗旱烟草品种选育中的应用。

背景技术：

植物从水生进化成陆生后，除拟南芥以外的陆生植物都具有多酚氧化酶（polyphenoloxidase,ppo）。ppo具有多种生理功能。首先，ppo在氧的作用下将无色单酚或者双酚类物质直接或者间接氧化成有色的醌类物质；其次，ppo在橙酮和b族维生素的次生代谢方面也具有重要的生理功能；最后，ppo在植物受到逆境胁迫也发挥重要的生理功能。例如，当植物受到外界生物性因素如昆虫、病原菌的侵害时，ppo基因会启动防御反应。当植物受到非生物因素如环境温度极度变化时，可能由于活性氧（reactiveoxygenspecies,ros）浓度变化介导ppo基因启动了应激反应。有研究表明橄榄树抑制ppo活性导致酚醛氧化程度降低，并且显示出更佳的抗氧化能力。细胞程序死亡研究中，在胡桃中沉默ppo基因能够导致酪氨酸增加，延缓了由于酪氨酸的降解导致细胞死亡。番茄中通过转基因的方法降低ppo的活性提高了抗干旱的能力。相对于抗病方面的研究，ppo基因参与非生物性因素胁迫方面的研究及其机理并不十分清晰。

植物中ppo基因不仅功能复杂，而且大多以基因家族的形式存在，并且家族成员众多。例如，马铃薯中经过鉴定的ppo有9个，番茄7个，玉米6个，大豆11个，而在丹参中甚至多达19个。不仅如此，ppo基因往往以串联的形式存在，如马铃薯的ppo主要串联在8号染色体的一段区域；番茄的7个基因位于8号染色体165kb的一段区域等。ppo在同种属植物中的序列具有高度相似性。ppo基因在茄子与马铃薯的之间dna序列相似性为82%，与番茄基因序列相似性为84.9%。

根据普通烟草基因组数据库中序列同源性分析表明，烟草中多酚氧化酶基因可能有12个。烟草中多酚氧化酶基因功能并不清楚。发明人在研究过程中，意外地发现两个基因序列高度相似的烟草多酚氧化酶(基因登录号分别为xm_009626443.2和xm_016636200.1)，命名为ntppo2a与ntppo2b对干旱胁迫中烟株存活有重要作用。经qpcr检测表明：ntppo2a与ntppo2b主要在烟草的根部表达；通过激素处理实验表明ntppo2a与ntppo2b响应外源脱落酸诱导，推测其可能参与了烟草抗旱生理过程。为进一步研究其功能，采用crispr/cas9技术同时突变ntppo2a与ntppo2b，通过自交后获得烟草多酚氧化酶ntppo2a与ntppo2b双基因的定点突变体。干旱胁迫后覆水实验表明，ntppo2a与ntppo2b双突变体植株的成活率显著低于对照，预示着其可能与干旱胁迫过后烟株的恢复有关。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b在抗旱烟草品种选育中的应用。

ntppo2a核苷酸序列如seqid：no.1所示，ntppo2b核苷酸序列如seqid：no.2所示。

ntppo2a编码的氨基酸序列如seqidno：3所示；ntppo2b编码的氨基酸序列如seqid：no.4所示。

烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b的定点突变方法包括以下步骤：

a、载体构建：将靶基因连接进puc57-kan大肠杆菌质粒，以该质粒为模板，高保真dna聚合酶以及m13引物pcr扩增合成基因片段，利用大肠杆菌质粒扩繁；摇过夜培养的大肠杆菌从培养管中倒入预冷的离心管中，离心收集菌体，弃上清；提取质粒，质粒和pcr产物利用bsai酶切；回收酶切产物，回收后的bsai产物利用t4连接酶连接；连接好的载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，选用pore-crispr/cas9载体上距离bsai酶切位点上游的一段序列作为上游引物，与sgrna2基因靶位点引物dna的反向引物配合pcr检测阳性菌落；pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证；

b、pore-crispr/cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化：测序正确的菌落，进行小摇(5ml)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌lba4404；菌株在含卡那霉素抗性的lb培养基平板上进行筛选培养，测序正确的农杆菌斑进行大摇(500ml)扩繁培养，离心收集菌体，用ms液体培养液重悬菌体，测量菌液的od值达到0.5后，浸染烟草k326叶盘8-10min；侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有naa、6-ba和卡那霉素(50mg/l)以及头孢噻肟钠(500mg/l)的ms固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。

a步骤中靶基因序列为seqid：no.5。

烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b的检测方法包括以下步骤：提取总rna，利用实时荧光定量pcr进行检测分析，内参基因为26s；

ntppo2aqpcr引物：

ntppo2a_qrt_f：5’-gcggttagatttaaacccatgacc-3’；

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26s内参基因引物:

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烟草品种中的烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b发生突变时，该品种抗旱性能降低。

本发明为烟草多酚氧化酶基因家族功能鉴定奠定基础，并为烟草品种选育提供了基础材料与检测方法。

附图说明

图1为靶基因合成示意图，包括trna序列，sgrna序列，gdna。

图2为ntppo2a与ntppo2b基因翻译蛋白序列比较，注：高亮标记ntppo2a，ntppo2b氨基酸残基之间的差异。

图3为ntppo2a，ntppo2b在烟草组织中的基因表达。

图4为ntppo2a与ntppo2b响应aba信号处理。

图5为ntppo2a与ntppo2b基因突变载体测序图，注：a为pore/cas9空载体，b为插入人工合成基因的pore/cas9载体；高亮部分即为人工合成靶基因序列。

图6为ntppo2a与ntppo2b双基因突变类型，w：野生型；m1，m2为ntppo2a，2b双基因纯合突变体；高亮显示基因突变靶位点序列，箭头指示基因序列突变位置。

图7为ntppo2a/ntppo2b双突变降低了干旱胁迫后烟株的成活率。

具体实施方式

本发明提供一种本发明的目的在于提供烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b在抗旱烟草品种选育中的应用。

ntppo2a核苷酸序列如seqid：no.1所示，ntppo2b核苷酸序列如seqid：no.2所示。

ntppo2a编码的氨基酸序列如seqidno：3所示；ntppo2b编码的氨基酸序列如seqid：no.4所示。

烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b的定点突变方法包括以下步骤：

a、载体构建：将靶基因连接进puc57-kan大肠杆菌质粒，以该质粒为模板，高保真dna聚合酶以及m13引物pcr扩增合成基因片段，利用大肠杆菌质粒扩繁；摇过夜培养的大肠杆菌从培养管中倒入预冷的离心管中，离心收集菌体，弃上清；提取质粒，质粒和pcr产物利用bsai酶切；回收酶切产物，回收后的bsai产物利用t4连接酶连接；连接好的载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，选用pore-crispr/cas9载体上距离bsai酶切位点上游的一段序列作为上游引物，与sgrna2基因靶位点引物dna的反向引物配合pcr检测阳性菌落；pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证；

b、pore-crispr/cas9表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化：测序正确的菌落，进行小摇(5ml)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌lba4404；菌株在含卡那霉素抗性的lb培养基平板上进行筛选培养，测序正确的农杆菌斑进行大摇(500ml)扩繁培养，离心收集菌体，用ms液体培养液重悬菌体，测量菌液的od值达到0.5后，浸染烟草k326叶盘8-10min；侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有naa、6-ba和卡那霉素(50mg/l)以及头孢噻肟钠(500mg/l)的ms固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。

a步骤中靶基因序列为seqid：no.5。

烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b的检测方法包括以下步骤：提取总rna，利用实时荧光定量pcr进行检测分析，内参基因为26s；

ntppo2aqpcr引物：

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烟草品种中的烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b发生突变时，该品种抗旱性能降低。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

1材料与方法

1.1材料

栽培烟草品种（nicotianatabacum）k326、yun87、dh5α大肠杆菌与lba4404农杆菌感受态为云南省烟草农业科学研究院实验室保存。pore-crispr/cas9植物表达载体由西南大学惠赠。引物合成和测序均由上海英潍捷基贸易有限公司（invitrogen）完成。化学合成基因序列由金斯瑞生物科技公司完成。

载体构建

1.2.1靶序列设计

根据ntppo2a与ntppo2b基因序列分别设计了2条sgrna序列，sgrna1：aacattaggaggaaaacgca；sgrna2：gacattaggaggaaaacgca。按照bsai+gatt+trna+sgrna1+grna+trna+sgrna2+gtttt+bsai核苷酸序列（图1）顺序化学合成基因序列，合成好的基因连接进puc57-kan大肠杆菌质粒。

1.2.2靶序列pcr扩增

以含有合成基因的puc57-kan质粒为模板，高保真dna聚合酶（q5neb）以及m13引物pcr扩增合成基因片段。反应如下：

pcr扩增体系为50µl，其中包含10µl的5xbuffer（10mmtris-hcl，50mmkcl，1.5mmmgcl2，ph8.3@25℃。），4µl的2.5mmdntps（takarabiotechnologyco.ltd.,dalian,china），2µl浓度10µm的m13上下游引物，0.5µl的2000u/ml高保真dna聚合酶（neb），20-50ng模板puc57-kan质粒dna，最后用ddh2o补齐50µl。

反应条件为：95℃预变性5min，30个循环（95℃变性30ｓ，复性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5min，4℃保存。

1.2.3质粒扩繁

配制lb液体培养基（称取12.5glbbroth于1l试剂瓶，加入500ml蒸馏水，121℃高温高压灭菌20min）。取3mllb液体培养基于15ml离心管中，加入100mg/ml卡那霉素（kanamycin）溶液3ul，加入含有合成多敲除基因的靶位点序列大肠杆菌菌液2-3ml，37℃、220rpm培养过夜。

1.2.4质粒与pcr产物酶切

摇过夜培养的菌从培养管中倒入预冷的离心管中，13200rpm离心30-60s收集菌体，弃上清。利用试剂盒提取质粒（qiagenplasmidmidikit），质粒和pcr产物利用bsai酶切，反应条件如下：

37℃酶切4小时。

1.2.5酶切产物回收

酶切后的产物利用（qiaquickgelextractionkit）回收试剂盒回收。

1.2.6多基因敲除pore-crispr/cas9植物表达载体连接

回收后的bsai产物利用t4连接酶（neb）连接，反应条件如下：

25℃连接1小时。

1.2.7阳性菌落筛选

连接好的载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，选用pore-crispr/cas9载体上距离bsai酶切位点上游的一段序列作为上游引物：5'-ttaggtttacccgccaata-3'，与sgrna2基因靶位点引物dna的反向引物配合pcr检测阳性菌落。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序验证。

表达载体的农杆菌转化及烟草的遗传转化

测序正确的菌落，进行小摇(5ml)扩繁培养。提取质粒后转化农杆菌lba4404。菌株在含卡那霉素抗性的lb培养基平板上进行筛选培养，测序正确的农杆菌斑进行大摇(500ml)扩繁培养，离心收集菌体，用ms液体培养液重悬菌体，测量菌液的od值达到0.5后，浸染烟草k326叶盘8-10min。

侵染后的叶盘在25℃、黑暗条件共培养2天，被侵染的烟草叶盘转移至含有naa、6-ba和卡那霉素(50mg/l)以及头孢噻肟钠(500mg/l)的ms固体培养基中进行筛选，最终获得含抗性基因的阳性烟草小苗。

实时荧光定量pcr检测

提取野生型yun87和k326烟株（5~6片真叶期）根、茎、叶总rna，利用实时荧光定量pcr检测分析ntppo2a和ntppo2b在烟草组织特异表达。50umaba处理烟草的根，分别在0h，0.5h，1h，2h，4h取根样，并提取rna，利用实时荧光定量pcr检测aba处理后根中ntppo2a及ntppo2b基因表达情况。内参基因为26s。

ntppo2aqpcr引物：

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26s内参基因引物:

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26s_r：5’-tctccctttaacaccaacgg-3’。

干旱胁迫与覆水

m1和m2突变株系与对照k326烟株各取60株（5~6片真叶期），分为3组。烟株放置在28℃植物生长箱中，光照12h、黑暗12h。一周后，停止浇水，待突变株系与对照组所有烟株叶片全部萎蔫之后，第三天进行覆水恢复，1周后统计干旱胁迫覆水后各处理组的烟株成活率。

结果

2.1ntppo2a与ntppo2b蛋白序列比较

如图2所示，烟草ntppo2a与ntppo2b基因翻译出蛋白的都是由601个氨基酸残基组成，除了图中高亮显示的23个氨基酸残基，其余的氨基酸都保持一致，两个蛋白序列一致性高达96%，呈现出高度相似性。

ntppo2a与ntppo2b基因组织特异性表达

选取两个普通栽培烟草品种k326和yun87，利用荧光定量pcr检测ntppo2a，2b在烟草中的表达情况。如图3所示，ntppo2a，2b在yun87和k326烟草中组织特异性表达相同，都主要是在根中表达，在茎、叶片中表达量超过了机器检测下限。

ntppo2a与ntppo2b受aba诱导表达

利用50μm的aba处理幼苗期的根后，采用荧光定量pcr的方法检测0.5、1、2、4h时间点ntppo2a，2b基因表达情况。如图4所示，ntppo2a与ntppo2b会立即响应aba信号，表达量立即升高，随后降低。ntppo2a在yun87中表达呈现波浪起伏型，而在k326中从诱导表达高峰后就呈现直线下降，并无反复；ntppo2b被诱导后的表达的变化与ntppo2a基因表达类似，不同的是在k326中ntppo2b响应aba信号有些滞后。aba处理1h之后，k326中的ntppo2b基因表达达到峰值，而在yun87中0.5h就已经达到了峰值。

ntppo2a与ntppo2b双定点突变载体构建

为研究ntppo2a，2b基因功能，人工合成定点突变的ntppo2a，2b的靶序列通过酶切连接后构建入pore/cas9载体中，经测序验证序列正确后（如图5），转化农杆菌，含目标载体的农杆菌侵染烟草后，经过组培再生得到转基因烟株。

ntppo2a与ntppo2b定点双突变基因型鉴定

采用crispr/cas9技术创制同源基因ntppo2a，2b双突变体。如图6所示，相对于野生型烟株w，m1突变株系的ntppo2a基因序列在sgrna1靶序列位置缺失了2个碱基aa，同时ntppo2b在sgrna2靶序列位置缺失了1个碱基a。m2突变株系在目标靶位点序列处，ntppo2a缺失了4个aaaa碱基，ntppo2b插入了1个碱基c。

ntppo2a与ntppo2b定点双突变体干旱表型

如图7所示，干旱胁迫后，所有的烟株叶片都因为失水而萎蔫。覆水后，m1与m2双突变株系的成活率分别为78.33%、76.67%，显著低于对照组k326的91.67%。实验结果表明：ntppo2a与ntppo2b双突变降低了烟草受干旱胁迫覆水后的成活率。

ppos响应非生物性因素胁迫的机制并不清楚。目前推测ppos可能通过改变细胞内活性氧的水平抵御外界环境非生物性因素的胁迫。有研究表明当植物在受到外界环境诸如冷、热、干旱等胁迫时，体内的多酚会积累。植物为了适应环境的变化，必定存在某种抑制这种多酚升高的机制。有研究表明抑制植物体内的ppos以及pod酶活性会造成多酚氧化水平受到抑制，进而植物抗氧化能力相应增强。干旱处理植物后，转基因抑制或者过表达ppo基因的研究结果有的是相互矛盾的。例如，在番茄中rnai干扰ppo会造成其抗旱能力的增强；而在白三叶草中，干旱处理7天后，ppo过表达提高了植株覆水后的存活率^[21]。从进化的角度来看，植物从水生到陆生，植物中ppo的经过自然选择应该是有利于干旱胁迫后植物的生存。最新在桑树^[22]中克隆了一个转录因子mnmyb3r1，过表达后能够上调烟草中的ppo基因的表达，证明了ppos基因参与了aba激素信号通路的干旱胁迫过程。

陆生植物体内存在多个ppos基因的事实可能导致了单独沉默某个ppo基因对植物的生长发育并没有什么影响。已经有研究表明转基因抑制植物中的ppo并不会对植株的生长发育有显著的影响。如在番茄中通过基因沉默的方法抑制ppo酶的活性，其生长发育以及产量与非转基因的对照相比无差别。在红三叶草中的基因沉默ppo的品系中，其含氮量与对照也无差别。但是，随着cripsp/cas9基因技术的进步，应用于植物体中定点敲除多基因家族具有无可比拟的优势。首先，区分植物体内的ppo基因的组织表达特异性，然后有针对性同时敲除某几个ppo基因应能鉴定出植物体内某几个ppo基因的具体功能。

本发明选取了2个序列高度相似的多酚氧化酶基因ntppo2a和2b。经qpcr检测表明：ntppo2a与ntppo2b主要在烟草的根部表达并能响应外源脱落酸诱导，推测其可能参与了烟草抗旱生理过程。为研究其功能，采用crispr/cas9技术同时定点突变ntppo2a与ntppo2b，获得两个双定点突变株系m1与m2。m1突变株系ntppo2a与ntppo2b分别缺失了2个a碱基和1个a碱基。m2突变株系ntppo2a与ntppo2b分别缺失了4个a碱基和插入1个c碱基。干旱处理后，m1和m2突变体覆水后的成活率显著低于对照k326，说明ntppo2a与ntppo2b对干旱胁迫后植株的生存有影响。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>烟草多酚氧化酶基因ntppo2a和/或ntppo2b在抗旱烟草品种选育中的应用

<130>2019

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<170>patentinversion3.3

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