扁刺蛾核型多角体病毒及其生产方法与流程

本发明属于病毒技术领域，具体涉及一种扁刺蛾核型多角体病毒及其生产方法。

背景技术：

扁刺蛾(thoseasinensiswalker)属于鳞翅目中的刺蛾科，又名黑点刺蛾、洋辣子。扁刺蛾分布广(东南亚一些国家和我国23个省份均有分布)、食性杂(寄主达37科71种)，主要寄主有油茶、茶树、核桃、柿、枣、苹果、梨、乌桕、枫香、枫杨、杨、大叶黄杨、柳、桂花、苦楝、香樟、泡桐、油桐、梧桐、喜树、银杏、桑、栎、板栗等林木和果树。

扁刺蛾在南昌一年发生2～3代，幼虫龄期为：一龄2天，二龄3～4天，三龄5～6天，四龄7～8天，五龄6～9天，六龄5～10天，幼虫历期约28～40天左右，为害时间从5月到10月长达半年。扁刺蛾在南昌的寄主达30科43种植物，是江西省的主要食叶害虫之一，低龄幼虫可将叶片吃成网状，残留叶脉，4龄后则食成缺刻和孔洞，仅留叶柄和主脉。6龄后食量大增，将全叶食尽，造成果实减产。一般情况下叶片损失10％～15％，严重时可达30％以上；扁刺蛾聚集产卵及幼虫间的相互吸引导致扁刺蛾幼虫在某一棵寄主上高密度聚集，食光整棵树的叶片，严重时导致树木死亡。

扁刺蛾幼虫除危害树木外，幼虫触及人的皮肤可引起皮炎，受刺部位有剧烈灼痛感，重者剧痛难忍，少数可伴有头痛、头昏、恶心、呕吐、心悸、周身不适及局部淋巴结肿痛等症状，刺蛾变应原似可引起变应性哮喘。因此防治扁刺蛾，既有生产上的经济价值，又具有保障人类身心健康的重要意义。

蔡秀玉等于1964年7月在北京首次发现扁刺蛾核型多角体病毒(thoseasinensisnuclearpolyhedrosisvirus，tsnpv)，其后相继在江西、河北、安徽、湖南、山东也发现tsnpv。该病毒能够通过水平扩散和垂直传递在扁刺蛾种群内传播，自然感染率一般为43％，高时可达70～87.2％以上，甚至达100％，是控制扁刺蛾种群数量的重要生物因子。安徽省农业科学院植物保护研究所生防室等对tsnpv进行了毒力测定、寄主专一性试验、毒性试验和田间实验，经室内和田间试验，这种病毒的毒力和寄主专一性很强，对扁刺蛾的防治效果较高(用6亿pib/毫升、0.6亿pib/毫升、0.06亿pib/毫升三种浓度喷雾感染不同龄期扁刺蛾幼虫15天，2龄幼虫死亡率为100％、100％、66.7％；3龄幼虫死亡率为100％、100％、96.2％；4龄幼虫死亡率均为100％；5龄幼虫死亡率为100％、96.8％、85.9％；6龄幼虫为33.8％、18.9％、42.8％。)，对褐刺蛾、绿刺蛾有一定感染力，对桑蚕、小白鼠无毒。采用的从防治田园内采集感染病毒而死的扁刺蛾幼虫，碾碎后用水稀释到一定浓度，得到的核型多角体病毒，再用来喷雾防治扁刺蛾的方法，不需贵重设备，简便易行，成本较低的优点，便于推广应用。可见tsnpv对扁刺蛾有较强的毒力，tsnpv对人和脊稚动物无感染性、致病性和其它毒性(安徽省农业科学院植物保护研究所生防室等.扁刺蛾核型多角体病毒的研究[j].微生物学通报,1979(5):14～16)，而且能够通过水平扩散和垂直传递在害虫种群内形成病毒。

近年来，扁刺蛾在南昌各小区、道路、果园和茶园泛滥成灾，防治扁刺蛾可采用人工抓捕扁刺蛾幼虫，清除虫茧，用灯诱杀成虫等辅助手段，目前主要是用化学农药防治。但化学农药的大量使用，不仅造成林区的农药残留超标，而且在杀灭害虫的同时也伤害了害虫的天敌(螳螂、猎蝽、剌蛾广肩小蜂、刺蛾紫姬蜂、寄蝇、绒茧蜂、赤眼蜂等)，破坏了生态平衡，同时还容易引起害虫的抗药性，不利于有害生物的可持续控制。最好的办法是采用生物防治，其中喷施tsnpv病毒制剂是最有效的手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种毒力更强的扁刺蛾核型多角体病毒及其生产方法。

为实现上述目的，本发明提供一种扁刺蛾核型多角体病毒(thoseasinensisnuclearpolyhedrosisvirus，tsnpv)，该病毒为扁刺蛾核型多角体病毒南昌株(thoseasinensisnuclearpolyhedrosisvirus-nanchang，tsnpv-nc)，于2019年10月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201975。

本发明还提供上述扁刺蛾核型多角体病毒在防治扁刺蛾中的应用。

本发明还提供一种杀虫剂，包含上述所述的扁刺蛾核型多角体病毒。

本发明还提供上述所述的扁刺蛾核型多角体病毒的生产方法，包括，

(1)采集扁刺蛾，用人工饲料饲养，所述人工饲料包含熟黄豆粉80～100g、熟小麦粉80～100g、酵母粉10～20g、蔗糖50～70g、甘氨酸1～1.5g、琼脂10～15g、vc0.5～1.5g、复合vb0.5～1.5g、尼泊金乙酯0.3～0.8g、10％氢氧化钠30～40ml，自来水600～1000ml；

(2)用含有所述扁刺蛾核型多角体病毒的人工饲料喂饲扁刺蛾幼虫，喂饲24～36h后，开始喂饲无毒人工饲料，直至扁刺蛾全部死亡。

(3)收集扁刺蛾虫尸，获得所述扁刺蛾核型多角体病毒。

较佳地，步骤(1)中，扁刺蛾幼虫阶段在智能光照培养箱内饲养，控制温度为28±1℃，相对湿度80％～90％，光周期l：d＝16：8，成虫阶段在温室内进行，温度20～32℃，平均25℃，相对湿度80％～90％，自然光照。

较佳地，步骤(2)中，取扁刺蛾幼虫死亡的虫尸，用已灭菌的0.02mol/lph7.2pbs浸泡10min，激烈振荡或涡旋1min，用3层纱布过滤，滤液进行差速离心数次，先800r/min离心5min，取上清，再以4000r/min离心5min弃上清，无菌水悬浮，直至获得较纯净的多角体，获得所述扁刺蛾核型多角体病毒。

较佳地，步骤(2)中，所述扁刺蛾核型多角体病毒的浓度为1×10⁵pib/ml，所述扁刺蛾幼虫的虫龄为5～6龄。

本发明提供的扁刺蛾核型多角体病毒浓度为1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml感染扁刺蛾幼虫后2d内扁刺蛾幼虫出现了死亡，扁刺蛾幼虫死亡率随着感染剂量增加而相应提高，1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度感染扁刺蛾幼虫后8～9d内，扁刺蛾幼虫死亡率都达到了100％。1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度的半至死时间都为4d左右、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml、1×10²pib/ml、1×10¹pib/ml的4个浓度的半至死时间分别为6d、7d、8d和8d；因此，本发明提供的tsnpv病毒比安徽省农业科学院植物保护研究所生防室等分离的tsnpv具有更强的毒力，具有很好的开发应用前景。

本发明的扁刺蛾核型多角体病毒，材料为扁刺蛾核型多角体病毒南昌株(thoseasinensisnuclearpolyhedrosisvirus-nanchang，tsnpv-nc)，保藏日期为2019年10月25日，保藏编号为cctccno：v201975，分类命名为扁刺蛾核型多角体病毒南昌株tsnpv-nc(thoseasinensisnuclearpolyhedrosisvirusnanchang)，保藏单位名称为：中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学。

附图说明

图1为实施例1中幼虫感染病毒死亡后典型“液化型”病症图；

图2为实施例1中tsnpv多角体镜检图；

图3为tsnpv切片的200千伏冷冻透射电子显微镜图；

具体实施方式

为详细说明本发明的技术方案、构造特征、所实现的技术效果，以下结合具体实施方式和附图详予说明。

在以下实施例中，tsnpv病毒分离自江西省南昌市艾溪湖湿地公园里大叶黄杨扁刺蛾幼虫自然死亡的虫尸；供试扁刺蛾幼虫为江西省南昌市艾溪湖湿地公园里大叶黄杨生长的健康扁刺蛾幼虫；养虫器皿采购禧天龙迷你收纳盒；人工饲料采用大叶黄杨带叶片的枝条(饲喂前用无菌水洗涤3次，晾干，用紫外线照15min)。

实施例1tsnpv病毒分离、增值、提取及鉴定

把tsnpv病毒原液(分离自自江西省南昌市艾溪湖湿地公园里大叶黄杨扁刺蛾幼虫自然死亡的虫尸)用无菌水稀释至1×10⁶pib/ml，用塑料喷壶喷洒到大叶黄杨带叶片的枝条上，阴干后放入禧天龙迷你收纳盒内，接入采集的4～6龄扁刺蛾幼虫。28℃，光照周9：15饲养(光照饲养9h，黑暗饲养15h)至扁刺蛾幼虫全部死亡。期间每天注意观察，饲养48h后换上新鲜的大叶黄杨带叶片的枝条，及时取出病死扁刺蛾幼虫置4℃冰箱保存。

随后，取扁刺蛾幼虫死亡的虫尸，用已灭菌的0.02mol/lph7.2pbs浸泡10min，激烈振荡或涡旋1min，用3层纱布过滤，滤液进行差速离心数次(先800r/min离心5min，取上清；再以4000r/min离心5min弃去上清，无菌水悬浮)，直至获得较纯净的多角体为止。在光学显微镜下，用血球计数板计数并拍照，病毒液置4℃冰箱保存。

将纯化的病毒多角体迅速用电镜专用戊二醛前固定，用0.1mol/lpbs漂洗后，用1％四氧化锇后固定，用0.1mol/lpbs漂洗；用30％～100％丙酮梯度脱水；用环氧树脂包埋、聚合；半薄切片定位，超薄切片机切片。醋酸铀和梓檬铅溶液双染色染色后将制好的切片铜网置于200kv冷冻透射电子显微镜feitecnaig20下，加速电压为200v，拍摄电镜照片。

结果如图1、图2及图3所示，扁刺蛾幼虫感染病毒后食欲减退，行动迟缓，显病幼虫先期体色变黄，最后呈黄褐、灰褐或黑褐色，幼虫死亡后，躯体变软，体内组织液化，表皮松弛易破，流出乳白色至褐色脓汁，无臭味，呈典型“液化型”病症，见图1。取液化的扁刺蛾幼虫血细胞和脂肪组织压片，可以观察到在细胞核内增殖的核型多角体病毒，扁刺蛾核型多角体病毒tsnpv扩增成功。

扁刺蛾幼虫感染tsnpv病毒8d后全部死亡，收集虫尸用pbs浸泡，激烈振荡后差速离心提取tsnpv，用光学显微镜镜检可见折光性很强的病毒多角体，tsnpv镜检结果见图2，图中折光性很强的为病毒多角体。

经中科院武汉病毒研究所电镜室进行超薄切片电镜鉴定，此多角体病毒为不规则多面体，呈五边形至近圆形。病毒粒子杆伏，单粒包埋于蛋白质中，见图3。从感病幼虫的病症，多角体和病毒粒子的形态与大小，按国际病毒分类委员会第四次报告，该病毒属杆状病毒科，经鉴定为核型多角体病毒。

实施例2tsnpv病毒的生测试验

将tsnpv病毒用无菌水进行梯度稀释成1×10⁷pib/ml，1×10⁶pib/ml，1×10⁵pib/ml，1×10⁴pib/ml，1×10³pib/ml，1×10²pib/ml，1×10¹pib/ml的6个浓度。用每个浓度tsnpv病毒液分别浸泡大叶黄杨带叶片的枝条，晾干，进行喂饲实验。每个浓度做为一组，每组放入一定数量的扁刺蛾幼虫，分别放在已消毒的容器内用湿纱布扎紧封口，涂无菌水作对照，重复2次。感染24h后加入新鲜清洁叶片继续饲养。按试验要求进行观察记载。计算死亡率，计算个不同病毒浓度的致死中时间，所得数据应用spss软件进行方差分析。

结果如表1所示，从表中可见1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml感染扁刺蛾幼虫后2d内扁刺蛾幼虫出现了死亡，扁刺蛾幼虫死亡率随着感染剂量增加而相应提高，1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度感染扁刺蛾幼虫后8～9d内，扁刺蛾幼虫死亡率都达到了100％。1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度的半至死时间都为4d左右、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml、1×10²pib/ml、1×10¹pib/ml的4个浓度的半至死时间分别为6d、7d、8d和8d；可见我们分离的tsnpv病毒比安徽省农业科学院植物保护研究所生防室等分离的tsnpv具有更强的毒力，具有很好的开发应用前景。

表1tsnpv对扁刺蛾幼虫感染致死的平均校正死亡率

用spss软件进行方差分析，主体间效应的检验结果见表2，从病毒浓度、死亡时间和病毒浓度*死亡时间的sig值是0.0000小于0.01，说明不同浓度tsnpv在不同时间对扁刺蛾幼虫的致死作用效果差异显著。

表2主体间效应的检验

实施例3人工饲料饲养扁刺蛾生产tsnpv病毒的方法建立

3.1人工饲料饲养扁刺蛾

人工饲料的制备：熟黄豆粉90g，熟小麦粉90g，酵母粉15g，蔗糖60g，甘氨酸1.25g，琼脂12g，vc和复合vb各1g，尼泊金乙酯0.5g，10％氢氧化钾37.5ml，自来水800ml。将琼脂溶化后趁热加入尼泊金乙酯和氢氧化钾，搅拌均匀加入黄豆粉、小麦粉和酵母粉，不断搅拌，待温度降至60℃左右时加入维生素，继续搅拌均匀后立即进行分装。

扁刺蛾虫源的获得：从野外采集扁刺蛾老熟幼虫，用宿主植物带叶枝条喂饲至其化蛹，待其羽化成成虫，用蜂蜜水喂饲成虫至其交配产卵，收集卵块，用甲醛消毒，取孵化出的幼虫作为虫源。饲养条件：幼虫阶段在智能光照培养箱内饲养，控制温度为28±1℃，相对湿度80％～90％，光周期l：d＝16：8，成虫阶段在温室内进行，温度20～32℃，平均25℃，相对湿度80％～90％，自然光照。

分别用扁刺蛾人工饲料和宿主植物带叶枝条喂饲扁刺蛾刚孵化出的幼虫至其成蛹，蛹羽化成成虫后，再用蜂蜜水喂饲成虫至其交配产卵，分别计算用扁刺蛾人工饲料和宿主植物带叶枝条喂饲扁刺蛾幼虫6龄幼虫体长、重量、幼虫发育历期、蛹重、蛹期、羽化率、成虫重量、产卵量等指标，来评价饲料的营养状况，确定人工饲料对扁刺蛾生长发育的影响。饲养条件：幼虫阶段在智能光照培养箱内饲养，控制温度为28±1℃，相对湿度80％～90％，光周期l：d＝16：8，成虫阶段在温室内进行，温度20～32℃，平均25℃，相对湿度80％～90％，自然光照。

结果如表3所示，用该饲料饲养扁刺蛾，六龄幼虫平均体长21mm，六龄幼虫平均重量重达1.1g,发育历期28～35d，平均蛹重0.55g，蛹期9～15d，羽化率为98％，平均每只雌蛾产卵量116粒，可见本饲料饲养效果与用带叶枝条相当，达到了长期、大规模、继代饲养扁刺蛾的目的。

表3用扁刺蛾人工饲料和宿主植物带叶枝条喂饲扁刺蛾生长发育结果表

3.1tsnpv增殖最优条件的确定

将tsnpv病毒用无菌水进行梯度稀释成1×10⁷pib/ml，1×10⁶pib/ml，1×10⁵pib/ml，1×10⁴pib/ml，1×10³pib/ml，1×10²pib/ml的6个浓度，待用。分别选取4、5和6龄扁刺蛾幼虫各600头，把饲料用小刀分成1800小块(大概1头幼虫1d的食量)，每块饲料接入10μl稀释好的病毒，每个病毒浓度喂饲一个龄期的扁刺蛾幼虫100头，从第2d开始喂饲无毒的饲料，27℃，饲养至扁刺蛾幼虫全部死亡。期间每天注意观察，及时取出病死扁刺蛾幼虫置4℃冰箱保存。待扁刺蛾幼虫全部死亡后，分别收集虫尸，计算每种病毒浓度的半致死时间。

取扁刺蛾幼虫死亡的虫尸，用已灭菌的0.02mol/lph7.2pbs浸泡10min，激烈振荡或涡旋1min，用3层纱布过滤，滤液进行差速离心数次(先800r/min离心5min，取上清；再以4000r/min离心5min弃去上清，无菌水悬浮)，直至获得较纯净的多角体为止。在光学显微镜下，用血球计数板计数，计算不同龄期扁刺蛾幼虫单头的产毒量。

结果如表4所示，用1×10⁵pib/ml的tsnpv毒液喂饲5龄末或6龄初扁刺蛾来生产tsnpv都可以达到生产要求。

表4扁刺蛾tsnpv增殖表

用人工饲料饲养扁刺蛾幼虫(天然饲料受饲料植物生长季节的限制)，这样可以为病毒生产的工厂化、机械化、自动化创造了条件。用人工饲料饲养昆虫有以下优点：(1)不受季节的限制，可常年饲养；(2)不受寄主和土地限制，能大量饲养；(3)能减少或避免微生物感染及农药等因子的干扰；(4)易获得生理标准整齐一致的实验用虫；(5)能控制饲料的织成来研究昆虫的取食和发育。

本发明提供的扁刺蛾核型多角体病毒浓度为1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml感染扁刺蛾幼虫后2d内扁刺蛾幼虫出现了死亡，扁刺蛾幼虫死亡率随着感染剂量增加而相应提高，1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度感染扁刺蛾幼虫后8～9d内，扁刺蛾幼虫死亡率都达到了100％。1×10⁷pib/ml、1×10⁶pib/ml、1×10⁵pib/ml3个浓度的半至死时间都为4d左右、1×10⁴pib/ml、1×10³pib/ml、1×10²pib/ml、1×10¹pib/ml的4个浓度的半至死时间分别为6d、7d、8d和8d；因此，本发明提供的tsnpv病毒比安徽省农业科学院植物保护研究所生防室等分离的tsnpv具有更强的毒力，具有很好的开发应用前景。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，均属于本发明所涵盖的范围。