转LcSABP基因烟草耐纳米氧化锌的用途的制作方法

本发明涉及植物生物学领域，具体地涉及转lcsabp基因烟草耐纳米氧化锌的用途。

背景技术：

纳米金属颗粒是应用最为广泛的纳米材料之一，由于其同时具有金属毒性和纳米毒性两重效应，其环境行为和生态效应成为关注纳米颗粒与生态环境之间的相互作用及其可能带来的生态安全隐患的纳米毒理学的重点研究领域之一。

纳米氧化锌(nzno)颗粒是纳米金属颗粒中最常见、应用最广泛、同时也是对动植物毒性效应最明显的污染物之一。因其独特性质，nzno已经被广泛地用于化妆品、橡胶、医学、化学纤维、电子工业等领域，这也不可避免地增加了纳米氧化锌颗粒的环境暴露量。如果污泥含有高浓度的纳米氧化锌，农用地肥料的污泥利用将对植物生长和产量产生不利的影响。

水杨酸(sa)，又称邻羟基苯甲酸，是植物体内的一种小分子酚类化合物，研究发现，sa在植物中有包括对抗病虫害、寒冷、干旱、盐渍等逆境胁迫的能力，已被明确作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物抗逆生理活动中发挥重要作用。sa可通过影响酶活性、改善细胞结构、提高叶绿素和水的含量以及增强激素和蛋白防卫反应机制等作用机理增强植物的抗逆性。从枸杞中分离的lcsabp是sabp2基因的同源物，显著增强了过量表达该基因的转基因植物中的水杨酸含量(li等，2019)。然而，目前尚未有关于转lcsabp基因烟草耐纳米氧化锌的用途的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种转lcsabp基因烟草耐纳米氧化锌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

转lcsabp基因烟草耐纳米氧化锌的用途，所述lcsabp基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明的优点：

实验证明转lcsabp基因烟草提高对纳米氧化锌抗性，对研究植物抗逆性方面及纳米金属污染物的植物修复方面具有重要应用价值。

附图说明

图1是rt-pct鉴定结果。

图2是部分转基因株系lcsabp相对表达水平。

图3是烟草种子在浓度50mg/l纳米氧化锌处理下第20天的表型图。

图4是烟草种子在浓度50mg/l纳米氧化锌处理下第20天的根长。

图5是烟草苗在浓度0.5g/kg纳米氧化锌处理下第40天的表型图。

图6是烟草苗在浓度0.5g/kg纳米氧化锌处理下第40天的株高。

图7是烟草苗在浓度0.5g/kg纳米氧化锌处理下第40天的叶绿素含量。

图8是烟草苗在浓度0.5g/kg纳米氧化锌处理下第40天的净光合速率。

各图中wt为野生型烟草，lcsabp-oe3、lcsabp-oe7、lcsabp-oe9为转基因烟草的三个株系，“对照”为未经过纳米氧化锌处理，nzno指经纳米氧化锌处理。

具体实施方式

野生型烟草种子、营养土、蛭石、珍珠岩均为市售。

nzno试剂(纳米氧化锌)购自凯玛特(天津)化工科技有限公司。

固体培养基(ms培养基(msmedium)4.74g/l，蔗糖(sucrose)30g/l，琼脂粉(agar)7g/l，ph＝5.8)。

ms培养基购自天津鼎国生物公司。

叶绿素采用试剂盒测定。

净光合速率采用li-6400便携式光合作用测定系统(li-cor，usa)测定，在室温和大气co2浓度下测定，光照强度为600μmol/m²/s，叶温为25℃。

转基因烟草种子来源：采用(li,q.,etal.,2019.overexpressionoflcsabp,anorthologousgeneforsalicylicacidbindingprotein2,enhancesdroughtstresstoleranceintransgenictobacco.front.plantsci.10,200.)获得。

lcsabp基因的核苷酸序列用seqidno.1所示。(中华枸杞(lyciumchinensemill.))

为了验证转基因烟草种子是否含有lcsabp基因，进行了检测。

从通过卡那霉素筛选获得的转lcsabp基因烟草种子中提取rna后，进行rt-pcr和qpcr以获得阳性转基因品系(图1和图2)。然后，选择具有高表达水平的lcsabp的三个独立的转基因株系(株系3，株系7，株系9)，其被命名为lcsabp-oe3，lcsabp-oe7和lcsabp-oe9。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)烟草种子的处理：

挑取种皮完整且干燥的野生型烟草种子和转lcsabp基因烟草种子(以下简称转基因烟草种子)，用体积浓度为75％的乙醇水溶液，浸泡1分钟，用无菌水漂洗3次，再用含有效氯5％的次氯酸钠溶液浸泡18分钟，用无菌水漂洗3次后分别铺设于含有50mg/l纳米氧化锌和不含纳米氧化锌(对照)的固体培养基上，在25℃/22℃昼夜、光暗16h/8h交替的温室中培养，使种子萌发，并继续培养幼苗至收获。

图3中的幼苗拍摄于野生型烟草和转基因烟草lcsabp-oe3种植第20天。

图4根长测定于野生型烟草和转基因烟草lcsabp-oe3，lcsabp-oe7和lcsabp-oe9点种第20天。

由图3可知，转基因烟草种子和野生型烟草种子在暴露于nzno胁迫之前正常发芽，且发芽后以相似的形态生长。用50mg/l的nzno胁迫处理20天，野生型和转基因型种子发芽后幼苗生长发育都受到抑制，但转基因烟草显示出比野生型烟草更好的生长性能。在nzno胁迫下，野生型烟草显示出叶萎黄，转基因烟草表现出轻微的萎黄，且野生型烟草叶片数量更少，叶片大小以及根长都小于转基因烟草。

(2)烟草幼苗的处理：

挑取饱满均一成熟的野生型烟草种子和转基因烟草种子，分别将种子播种于装有营养土、蛭石和珍珠岩的塑料盆中，三者的体积比为2:2:1，在25℃/22℃昼夜、光暗16h/8h交替的温室中培养，待野生型烟草种子和转基因烟草种子萌发、生长。

30天后，选取长势一致的野生型烟草幼苗和转基因烟草幼苗，分别将其转移到含有纳米氧化锌浓度为0.5g/kg和不含纳米氧化锌(对照)的土壤的新盆中，每5天浇灌一次清水。

图5中的烟草苗拍摄于野生型烟草和转基因烟草lcsabp-oe3种植第40天，图6，7，8株高、叶绿素含量和净光合速率测定于野生型烟草和转基因烟草lcsabp-oe3，lcsabp-oe7和lcsabp-oe9处理第40天。

由图5可知，转基因和野生型烟草植物在暴露于nzno胁迫之前以相似的形态生长。用0.5g/kg的nzno胁迫处理40天，转基因烟草显示出比野生型烟草更好的生长性能，野生型烟草显示出叶片黄化且植株矮小，相反，转基因烟草只表现出轻微的黄化，且植株更高。

序列表

<110>天津大学

<120>转lcsabp基因烟草耐纳米氧化锌的用途

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>795

<212>dna

<213>中华枸杞(lyciumchinensemill.)

<400>1

atggcgactattgagaaagaaggaaagcactttgttttggtacatggtgtatgccatgga60

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