本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化酵母细胞微球及其制备方法与应用。
背景技术：
细胞固定化技术，是指将微生物细胞以物理或化学手段固定在一定载体上，该载体具有一定的亲水性但不溶于水，菌体被固定之后，在载体上的特定区域内可以进行正常生理代谢，不仅保持了菌体本身的催化和制备活性，还能够被多次回收利用，在连续操作中菌体也能保持较高的稳定性。因此，该方法是降低生产成本、控制反应过程、防止发酵过程中的染菌、产物与菌体快速分离的一种重要手段。固定化细胞技术从固定化酶的基础上发展而来，最大程度地保留了胞内天然环境，每一个细胞都是一个小型的天然反应器，也减少了细胞破碎、提取酶液等繁琐步骤带来的麻烦。
从上世纪五六十年代开始，固定化细胞技术便持续发展，在食品、环境、制药等各个领域被广泛应用，因其便捷，可重复使用等优良特性被越来越多的研究者注意并积极探索新的固定化材料和固定化方法。固定化细胞的方法可大致分为以下三种：
吸附法：分为物理吸附法和化学吸附法两种。物理吸附法利用固定化材料的大孔特性，使细胞截留在在载体内，或利用材料与微生物表面的静电引力，将细胞吸附于载体的表面。常见的吸附材料有硅胶、石英砂、活性炭等。化学吸附法主要利用微生物表面的一些活性基团(例如-nh2、-cooh等)与固定化材料表面的活性基团形成离子键或共价键，达到相互连接的目的。常用的材料有羧甲基纤维素、teae纤维素等。通过吸附法固定化细胞操作简单，作用条件温和，但是对载体的要求较高，而且通过作用力吸附全细胞，往往由于吸附力弱导致回收率低。
包埋法：包埋法是目前最常用的固定化方法。是指通过合适的载体材料将全细胞包埋在特定的微球内或网格空间中。一般要通过搅拌的方法使细胞和包埋材料的混合体系均匀分散。常见的包埋材料有海藻糖、石花菜胶、聚乙烯醇(pva)、壳聚糖等。包埋法固定化细胞具有操作简单、过程中细胞活力损失较少、适用范围广等优点。
交联法：是指不利用载体，利用常见的交联剂(如戊二醛等)对细胞间通过共价键结合将细胞固定起来的方法。但是由于共价键的结合过程对细胞活性损失较大，所以一般与其他固定化细胞方法结合使用，例如包埋-交联法，吸附-交联法等。
苯乙醇是一种天然香精物质，但是化学合成苯乙醇有原料毒性大、副产物多等缺点，而酵母细胞可将苯丙氨酸转化为苯乙醇，因此发酵法是生产苯乙醇的一种安全高效的方法。但是与其它醇类物质一样，高浓度苯乙醇对微生物细胞有一定的毒性，在发酵后期对产量有抑制作用。所以在高产苯乙醇的工艺过程中，必须要克服苯乙醇对酵母细胞的毒性抑制。从发酵工艺角度考虑，开发一种从发酵培养基中回收苯乙醇技术，是从发酵液中连续分离产物，解除抑制的一种十分有效的方法。但是苯乙醇分离技术的一大壁垒在于需要将菌体与发酵液分离开，采用全蒸发或离心等方式分离菌体的效率都比较低，或能耗较大，大大限制了苯乙醇发酵工艺的发展。因此许多研究致力于开发新型的菌体与发酵液的分离方法，专利cn109455828a中就公开了制备固定化细胞时使用磁性fe3o4并添加硅藻土吸附细胞，增加包埋效率的方案。但是该发明的固定化原理是固化，材料强度较低，且硅藻土的粒径约为3-5微米，比酵母细胞的6-7微米的粒径小很多，吸附效果不好，这些都影响最终的包埋效率差，影响最终的产品产量。因此需要改进方案以增加固定化细胞的包埋效率和使用性能。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是现有的固定化酵母细胞的包埋效率低(一般只能达到80％)、细胞活力损失大、最终的发酵产物苯乙醇回收过程困难、能耗大等问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种固定化酵母细胞微球，该固定化酵母细胞微球为球囊状结构，外壳是包埋材料，内部是包含酵母细胞的芯材。
在一些实施方案中，上述固定化酵母细胞微球中，所述包埋材料为甘油醛与聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物交联后的产物。
在一些实施方案中，上述任一所述的固定化酵母细胞微球中，所述聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物分子量为20kda-100kda，该嵌段共聚物可以用本领域常规的固相合成的方法制备，原理是氨基酸上的氨基和羧基能够发生脱水缩合反应生成酰胺键，从而生成长链氨基酸共聚物。
在一些实施方案中，上述任一所述的固定化酵母细胞微球中，所述固定化酵母细胞微球的内部芯材还包括吸附剂和磁性粒子；
所述吸附剂优选为al2o3多孔性颗粒，所述al2o3多孔性颗粒的粒径优选为6～10微米，平均7微米；
所述磁性粒子优选为fe3o4磁性纳米颗粒。
在一些实施方案中，上述任一所述的固定化酵母细胞微球中，所述固定化酵母细胞微球包含以下组分或由以下组分组成：所述包埋材料、酵母细胞、所述吸附剂和所述磁性粒子，例如可以由聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物与甘油醛的交联产物、酵母细胞、al2o3多孔性颗粒和fe3o4磁性纳米颗粒组成，这种微球为球囊状结构，外壳是包埋材料，内部芯材由酵母细胞、吸附剂和磁性粒子组成。
在一些实施方案中，上述任一所述的固定化酵母细胞微球中，所述酵母细胞可以使用常规的适合于培养酵母细胞的培养基进行培养，再将培养液进行离心、无菌水洗涤菌体得到酵母细胞，例如可以使用ypd培养基，于30℃，150-250rpm条件下震荡培养16～36h，将培养液在6000rpm～8000rpm条件下离心5min～15min，离心结束后，弃掉上层培养基得到菌体，用无菌水清洗菌体2～4次，即得到干净的酵母菌菌体，用于固定化。
在一些实施方案中，上述任一所述的固定化酵母细胞微球中，所述fe3o4磁性纳米颗粒按照化学共沉淀法制备：称量一定量的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o溶于超纯水中，在搅拌条件下将naoh水溶液滴加到铁盐溶液中，并检测溶液的ph值，当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，外加磁场分离得到的黑色fe3o4磁性纳米颗粒，用超纯水清洗至ph中性，真空干燥。
在一些实施方案中，上述固定化酵母细胞微球中，三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o的投料摩尔比为2:1～3:1，naoh水溶液浓度为0.1～1mol/l，在滴加碱溶液的过程中为防止氧化，该步骤应该在氮气保护条件下进行。
为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的固定化酵母细胞微球的制备方法，包括以所述聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物作为包埋剂对酵母细胞进行包埋的步骤。
在一些实施方案中，上述方法中，所述包埋剂还包含甘油醛。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述方法进一步包含加入所述吸附剂和/或所述磁性粒子的步骤。
在一些实施方案中，上述方法中，所述方法包括将所述聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物的水溶液与酵母细胞混合均匀，加入fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，混合均匀，得到混合液；将所述混合液滴加到等体积的甘油醛水溶液中，20-30℃交联；
聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物的水溶液制备时在向超纯水中加入聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物粉末之后，需加热促进其溶解。
在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物的水溶液的浓度为2％～5％，所述聚甘氨酸-丝氨酸的嵌段共聚物的分子量优选为20kda-100kda；和/或
所述混合液中所述酵母细胞的浓度为50～150g/l；和/或
所述混合液中所述fe3o4磁性纳米颗粒的浓度为0.5～2g/l；和/或
所述混合液中所述al2o3多孔性颗粒的浓度为1～5g/l，所述al2o3多孔性颗粒的粒径优选为6～10微米，平均7微米；和/或
所述甘油醛水溶液的浓度为5％～10％；和/或
所述交联反应的反应时间为10～60min。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种发酵生产苯乙醇的方法，包括使用上述任一所述的固定化酵母细胞微球发酵生产苯乙醇。
在一些实施方案中，上述发酵生产苯乙醇的方法中，固定化酵母细胞微球发酵生产苯乙醇时的发酵培养培养基为：酵母粉2～10g/l，kh2po42～10g/l，mgso40.1～0.5g/l，(nh4)2hpo42～10g/l，cucl20.01～0.1g/l，葡萄糖20～100g/l，l-苯丙氨酸5-20g/l；
将20-200g/l所述固定化酵母细胞微球于无菌条件下加入发酵培养基中发酵培养。
在一些实施方案中，上述任一所述的发酵生产苯乙醇的方法中，所述方法包括利用外加磁场将所述固定化酵母细胞微球与发酵液分离的步骤。
在一些实施方案中，上述任一所述的发酵生产苯乙醇的方法中，发酵中使用的发酵罐外设置有循环管路，将发酵液外循环，苯乙醇通过液液萃取的方式实现与发酵液分离，例如用正癸烷萃取发酵液中的苯乙醇。
在一些实施方案中，上述任一所述的发酵生产苯乙醇的方法中，苯乙醇产物的提取可以采用如下方式：在发酵进行36～72小时之后，使用外加磁场将所述固定化酵母细胞微球集中于发酵罐底部，用泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取；萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台泵循环回到发酵罐中，上述循环持续2～4小时后，发酵液中的大部分苯乙醇被萃取出来，达到连续分离苯乙醇的效果；
所述固定化酵母细胞微球在完成一批次的发酵实验后可反复使用进行发酵，使用次数达10～15次。
本发明以甘油醛和聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物两种物质的复合材料为包埋剂、al2o3多孔性颗粒为吸附剂、fe3o4磁性纳米颗粒为磁性粒子制备固定化酵母细胞微球。由于甘油醛分子携带醛基，而甘氨酸侧链上携带氨基，可以与醛基发生schiff碱反应形成交联，为了进一步巩固交联效果，聚甘氨酸的分子链上加入丝氨酸共聚，形成嵌段共聚物，丝氨酸侧链上携带羟基，能与醛基能发生缩合反应进一步形成交联，能够提高交联效率，使微球的机械强度更高，能够用于机械搅拌发酵的领域。并且，用粒径更大的多孔性al2o3固体颗粒替代硅藻土吸附细胞，增加了包埋效率。另外，使用本发明提供的固定化酵母细胞微球可以通过外加磁场实现发酵液与微球的快速分离，分离之后的发酵上清液能够快速进入后续处理步骤，并且固定化酵母细胞微球也可以重复利用，这大大增加了生产效率，降低了生产成本，能够应用于多种需要分离产物和菌体的发酵领域。
本发明提供的固定化酵母细胞微球包埋效率高、细胞活力损失小，在使用其发酵生产苯乙醇时可以实现发酵产物的快速分离并且该固定化酵母细胞微球可以重复利用，这大大增加了苯乙醇的生产效率，降低了生产成本，在发酵领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)购自广东省微生物菌种保藏中心，编号gim2.213。
甘油醛为阿拉丁试剂(上海)有限公司产品，货号s138916
聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物为吉尔生化(上海)有限公司产品。
al2o3多孔性颗粒为阿拉丁试剂(上海)有限公司产品，产品目录号为a102005，商品名为氧化铝，粒径为6～10微米，平均7微米。
下述实施例中的“％”用于表示浓度时，如无特殊说明，均表示“g/100ml”。
下述实施例中的包埋效率按照如下方法进行检测：取1ml固定化细胞制备时用于滴加到甘油醛水溶液的混匀液(包含聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物、酵母菌、fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒)，稀释十倍，用细胞计数器检测其中的酵母细胞数量，记为a。固定化酵母细胞后，取1ml离心之后的上清液，稀释十倍，用细胞计数器检测其中的酵母细胞数量，记为b；
包埋效率＝(a-b)/a。
下述实施例中的l-苯丙氨酸及苯乙醇含量按照如下方法进行检测：高效液相色谱，采用安捷伦zorbaxsb-c18分析色谱柱，柱温35℃，pda检测，波长214nm；流动相为10％甲醇与90％水的混合溶液，等度洗脱，流速为0.8ml/min；l-苯丙氨酸出峰保留时间为4.5min，苯乙醇保留时间为12.7min。
实施例1
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)接种至ypd培养基中，于30℃，150rpm条件下震荡培养16h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基。加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为3:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液，在三口瓶中持续机械搅拌。配置1mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制3％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为100kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒(作为吸附剂)，其中，酵母菌的终浓度为150g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为0.5g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为1g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的10％的甘油醛水溶液中，在室温(20℃)下交联反应20min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
所制备的固定化酵母细胞微球为球囊状结构，外壳是包埋材料，内部芯材由酵母细胞、吸附剂和磁性粒子组成。经过检测，包埋效率为88％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉2g/l、kh2po410g/l、mgso40.5g/l、(nh4)2hpo48g/l、cucl20.05g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为20g/l。在发酵罐中加入终浓度为15g/l的l-苯丙氨酸作为底物、80g/l葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵48h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积比为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续4小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至80g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用10次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.0-1.5g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为82％。
实施例2
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母接种至ypd培养基中，于30℃，150rpm条件下震荡培养24h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基。加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为2:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液，在三口瓶中持续机械搅拌。配置1mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制5％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为80kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，其中，酵母菌的终浓度为50g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为1g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为3g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的10％的甘油醛水溶液中，在室温(25℃)下交联反应40min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
经过检测，包埋效率为97％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉4g/l、kh2po48g/l、mgso40.4g/l、(nh4)2hpo46g/l、cucl20.08g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为80g/l。在发酵罐中加入终浓度为20g/l的l-苯丙氨酸作为底物、100g/l的葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵36h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续2小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至100g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用10次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.5-2.0g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为87％。
实施例3
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母接种至ypd培养基中，于30℃，250rpm条件下震荡培养16h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基。加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为2:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液，在三口瓶中持续机械搅拌。配置0.7mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐的混合溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制5％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为20kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，其中，酵母菌的终浓度为150g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为0.5g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为5g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的5％的甘油醛水溶液中，在室温(25℃)下交联反应60min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
经过检测，包埋效率为93％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉6g/l、kh2po48g/l、mgso40.5g/l、(nh4)2hpo42g/l、cucl20.01g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为120g/l。在发酵罐中加入终浓度为10g/l的l-苯丙氨酸作为底物、60g/l葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵72h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积比为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续4小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至60g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用10次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.2-1.7g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为84％。
实施例4
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母接种至ypd培养基中，于30℃，200rpm条件下震荡培养24h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基。加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为3:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液，在三口瓶中持续机械搅拌。配置0.1mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制5％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为100kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，其中，酵母菌的终浓度为50g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为2g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为1g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的8％的甘油醛水溶液中，在室温(30℃)下交联反应10min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
经过检测，包埋效率为91％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉8g/l、kh2po46g/l、mgso40.3g/l、(nh4)2hpo44g/l、cucl20.1g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为160g/l。在发酵罐中加入终浓度为5g/l的l-苯丙氨酸作为底物、20g/l葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵48h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积比为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续3小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至20g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用15次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.2-1.8g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为85％。
实施例5
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母接种至ypd培养基中，于30℃，250rpm条件下震荡培养36h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基，并加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为2:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液。在三口瓶中持续机械搅拌。配置0.5mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制2％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为60kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，其中，酵母菌的终浓度为100g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为0.5g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为5g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的5％的甘油醛水溶液中，在室温(20℃)下交联反应60min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
经过检测，包埋效率为90％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉10g/l、kh2po46g/l、mgso40.2g/l、(nh4)2hpo44g/l、cucl20.1g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为180g/l。在发酵罐中加入终浓度为20g/l的l-苯丙氨酸作为底物、50g/l葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵72h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积比为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续2小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至50g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用15次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.2-2.0g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为89％。
实施例6
一、菌体培养
配制ypd培养基，并于121℃下高温灭菌20min，将-20℃低温保存的酿酒酵母接种至ypd培养基中，于30℃，200rpm条件下震荡培养36h。将培养液转移至离心管中，8000rpm离心10min后，弃掉上层培养基。加入无菌水重悬酵母细胞，再次离心，如此用无菌水清洗3～4次，得到清洗洁净后的酵母菌。
二、fe3o4磁性纳米颗粒的制备
于称量纸上称投料摩尔比为3:1的三价铁盐fecl3·6h2o和二价铁盐fecl2·4h2o，溶于100ml超纯水中，得到总铁含量为0.4mol/l的铁盐溶液，在三口瓶中持续机械搅拌。配置0.1mol/l的naoh水溶液，在氮气保护下将其缓慢滴加到铁盐溶液中，溶液中开始出现黑色的fe3o4沉淀。当ph为10左右时停止滴加naoh水溶液，在外加磁场的条件下，将fe3o4磁性纳米颗粒从溶液中分离出来，用超纯水反复清洗至ph中性，并于50℃下真空干燥24h，得到干燥的fe3o4磁性纳米颗粒。
三、固定化细胞的制备
配制2％的聚甘氨酸-丝氨酸嵌段共聚物(分子量为20kda)水溶液，与步骤一清洗洁净后的酵母菌混合均匀，并加入步骤二制备的fe3o4磁性纳米颗粒和al2o3多孔性颗粒，其中，酵母菌的终浓度为150g/l，fe3o4磁性纳米颗粒的终浓度为2g/l，al2o3多孔性颗粒的终浓度为1g/l，利用机械搅拌将上述材料混合均匀。用针式注射器将混合液逐滴缓慢加入到等体积的10％的甘油醛水溶液中，在室温(25℃)下交联反应60min，以固定化酵母细胞。将固化后的混合液转移至离心管中，8000rpm离心30min后，弃掉上清液，下层固定化酵母细胞微球用超纯水反复清洗3～4次后保存于ph＝7.4的pbs溶液中。
经过检测，包埋效率为90％。
四、固定化细胞发酵苯乙醇
配制基础培养基置于发酵罐中，基础培养基配方为：酵母粉10g/l、kh2po42g/l、mgso40.1g/l、(nh4)2hpo410g/l、cucl20.08g/l，余量为水。121℃下高温灭菌20min后向发酵罐中加入步骤三制备的固定化酵母细胞微球使其终浓度为200g/l。在发酵罐中加入终浓度为15g/l的l-苯丙氨酸作为底物、100g/l葡萄糖作为碳源，在30℃，250rpm下进行苯乙醇发酵培养。发酵72h后，停止搅拌，在发酵罐底部外加磁场将固定化酵母细胞微球集中。用隔膜泵将上层发酵清液抽出，经过管路上的滤膜过滤后，清液进入萃取塔，加入正癸烷进行萃取，其中，正癸烷与发酵液的体积比为1:10。萃取完成后的上清液进入精馏塔，精制苯乙醇，下层水相通过另一台隔膜泵循环回到发酵罐中，再用隔膜泵将上层发酵清液抽出进行上述萃取、循环，持续4小时后关掉泵，停止外循环萃取，撤去外加磁场，使得固定化酵母细胞微球自由分散于发酵罐中，开启葡萄糖补料至100g/l，继续进行发酵反应。该固定化酵母细胞微球可反复使用15次。经过hplc检测，最终苯乙醇产率为1.0-1.5g/l/h，l-苯丙氨酸转化率为84％。