一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：抗生素自发现以来，给人类医疗和畜牧养殖业带来了极大的益处。然而，随着抗生素的长期使用，病原菌的耐药性增加、畜禽产品中抗生素的残留及过量排泄对环境的污染等问题给人类健康带来了新的挑战。随后，各国相继颁布禁令，限制并禁止抗生素在畜牧养殖中的应用。1986年，瑞典成为第一个规定畜禽饲料中禁用抗生素的国家，紧接着欧盟、韩国、美国等相继提出禁止抗生素用作饲料添加剂。我国农业农村部于2019年宣布药物饲料添加剂将在2020年全部退出。然而随着养殖业的扩大，畜牧养殖业的发展已不单单局限于生产性能，畜牧产品的质量与安全性越来越被人类所重视。因此，寻找抗生素的替代产品势在必行。技术实现要素：本发明提供一株可用于畜牧产品的细菌。本发明所述的细菌是一株枯草芽孢杆菌bsc16a，这一菌株已经于2019年9月6日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名称为枯草芽孢杆菌bacillussubtilis，保藏编号为cgmccno:18473。本发明所述的枯草芽孢杆菌bsc16a可在猪、仔猪、牛、犊牛、羊和羔羊饲料中的应用，也可在饲料中的应用，同时也可将这一菌株用于制备用于治疗猪、牛、羊腹泻的兽药。更进一步，本发明的枯草芽孢杆菌可用于制备益生菌制剂。本发明的一株枯草芽孢杆菌bsc16a分离自健康猪的新鲜粪便。本发明提供的菌株对酸、胆盐及胃肠道有很好的耐受性，并且能抑制多种病原菌的生长，如致病性大肠杆菌、单增李斯特氏菌、普通变形杆菌及产气荚膜梭菌等多种病原菌。本发明提供的菌株有极强的产蛋白酶和淀粉酶能力，且对caco-2细胞黏附能力较强。本发明提供的菌株有提高育肥猪生长性能和机体免疫力，并降低肠道内大肠杆菌的数量的作用。试验表明，选择日龄和体重相近的健康育肥猪30头，随机分为试验组和对照组，每组15头。试验组饲料为基础日粮中添加本发明枯草芽孢杆菌，剂量为2×108cfu/ml/头/天，对照组饲喂正常的基础日粮，试验期为60d。试验结束后，试验组平均体重和平均日增重均高于对照组；试验组igg、igm、ifn-γ及il-2的分泌水平均高于对照组；试验组粪便中乳酸菌含量高于对照组，芽孢杆菌含量略高于对照组，大肠杆菌含量低于对照组。将本发明提供的枯草芽孢杆菌与其他益生菌菌株配伍成复合微生态制剂，应用于腹泻仔猪中，有减缓和治愈腹泻病的作用，且效果明显，本发明菌株可应用畜牧养殖中。益生菌作为一种绿色、安全、无残留的新型抗生素替代品已得到广泛的关注和研究。美国fda和美国饲料控制官员协会于1989年公布了42种可直接饲喂动物的微生物菌种名单，2009年将微生物菌种补充至46种，我国农业部于2013年也提出了可用于饲料添加的34种益生菌，其中均包含了枯草芽孢杆菌，该类菌株一般被认为是安全的。枯草芽孢杆菌属于单细胞原核生物，一般无荚膜，周生鞭毛、并且能运动。枯草芽孢杆菌是一类抗逆性极强的革兰氏阳性菌，可在恶劣环境下形成休眠芽孢体来保护菌体。枯草芽孢杆菌进入动物肠道后可通过以下方式发挥益生作用：(1)消耗氧气，降低肠道氧浓度和氧化还原电位，保持乳酸菌等厌氧益生菌的生长，促进动物生长；(2)通过分泌抑菌素或产生酸类物质降低肠道ph值的方式抑制病原微生物等的生长；(3)产生多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，促进动物消化吸收，提高饲料利用率，此外，枯草芽孢杆菌具有降解木聚糖、果胶、纤维素，分解硫化物等能力；(4)黏附并定植于肠道中，阻止病原菌对肠道黏膜的侵袭，对肠道黏膜屏障发挥保护和修护作用；(5)产生多种营养物质，如维生素b族、维生素c、氨基酸、促生长因子等，激活免疫细胞活性并促进动物生长发育；(6)加快免疫器官发育，刺激机体免疫系统，提高机体免疫功能。在畜牧养殖业中，腹泻病(diarrheadisease)是严重影响我国畜牧业健康发展的一个因素。腹泻会导致动物肠道功能衰退，影响肠道消化吸收，从而导致营养不良，影响身体健康。引起腹泻的因素可分为感染性因素和非感染性因素两大类，感染性因素主要包括细菌性腹泻、病毒性腹泻和寄生虫性腹泻；非感染性因素有环境因素、饲养管理不当、动物自身因素等。动物腹泻大多发生于幼畜中，严重时可导致幼畜死亡。已有研究表明，在初生动物尚未建立肠道菌群阶段通过补充益生菌可尽快建立胃肠道正常的微生物群，能够增加幼畜体内有益菌群来抑制致病微生物侵袭从而减少腹泻的发生。益生菌制剂可有效预防仔猪发生腹泻，避免仔猪因腹泻而死亡。此外，养殖动物的生长性能、饲料利用率是另一个影响经济发展的重要因素。益生菌可以促进动物机体对饲料中各种营养成分的消化吸收，促进动物机体的生长发育，降低饲料成本。因此，选择合适的益生菌作为饲料添加剂来增强幼畜机体抵抗力，降低腹泻率，提高动物生长性能具有重要意义。附图说明图1，枯草芽孢杆菌bsc16a单菌落形态图。菌株bsc16a在na平板上呈白色，扁平状，圆形或不规则，表面粗糙且不透明。图2，枯草芽孢杆菌bsc16a革兰氏染色镜检图。在油镜下呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，单个、成对或簇状分布，单个细胞大小约为0.7μm×2μm～3μm。图3，枯草芽孢杆菌bsc16a的pcr扩增图。第一泳道为dna分子质量为2000的dnamarker。1、2泳道为菌株ghz10a的片段长度，约为1500bp。图4，枯草芽孢杆菌bsc16a抑制大肠atcc43888图。图5，枯草芽孢杆菌bsc16a抑制金黄葡萄球菌atcc6538图。图6，枯草芽孢杆菌bsc16a的生长曲线图。图7，枯草芽孢杆菌bsc16a的蛋白水解图。具体实施方式以下是结合附图详细阐述本发明的方案。实施例一枯草芽孢杆菌的分离和鉴定1.1菌株的分离本发明枯草芽孢杆菌bsc16a(bacillussubtilisbsc16a)分离并筛选自四川省健康猪的新鲜粪便，样品共计86份。具体分离纯化方法为：称取粪便样品10g，用90ml无菌pbs稀释混匀后过滤，取1ml滤液离心，弃上清；用1ml营养肉汤培养液重悬后于37℃恒温培养箱中振荡培养48h，80℃加热处理10min，离心，弃上清；再次加入1ml营养肉汤培养液，涡旋后37℃振荡培养24h；混合液适量稀释后涂布于营养琼脂(na)平板上并37℃培养10h。本发明上述使用的无菌pbs配方如下：称取nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.42g，kh2po40.27g加入到800ml去离子水中，充分搅拌溶解后，加去离子水定容至1l，滴加盐酸调节ph至7.4后，121℃高压灭菌20min，室温保存备用。本发明上述营养肉汤培养基配方如下：营养肉汤培养基：称取蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，nacl5.0g加入去离子水中，定容至1l后调节ph为7.3±0.2，121℃高压灭菌20min，4℃保存。营养琼脂(na)培养基：在营养肉汤培养基的基础上中加入15g琼脂粉。从na平板上挑取枯草芽孢杆菌疑似株952株并依此编号，分别在na平板上划线纯化；待各分离株纯化后，各挑一单菌落于营养肉汤培养基中37℃、振荡培养18h后保存菌液，备用。1.2菌株的形态观察菌株bsc16a在na平板上呈白色，扁平状，圆形或不规则，表面粗糙且不透明(图1)。菌株bsc16a革兰氏染色后油镜下观察为革兰氏阳性，菌体呈蓝紫色杆状，单个细胞大小为0.7μm×2μm～3μm(图2)。1.3菌株的分子生物学鉴定用dna提取试剂盒提取上述分离株的基因组，采用细菌鉴定16srdna通用引物27f及1492r，特异性引物gyra、gyrb及groel等扩增，pcr扩增程序如下：95℃，5min；95℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；重复35个循环；72℃，8min；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定得到长度约为1500bp的目的片段(图3)。pcr产物送至西安擎科泽西生物有限公司测序，序列提交ncbi进行blast比对分析，上述952株新分离菌株中，673株为枯草芽孢杆菌，其余为地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。其中分离株bsc16a序列与bacillussubtilis的序列同源性为100％，结合特异性引物鉴定结果及系统发育树同源性分析，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。将bacillussubtilisbsc16a基因序列提交ncbi数据库，申请获得登录号为mk208493。该菌株于2019年9月6日提交并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno:18473。实施例二枯草芽孢杆菌的筛选2.1耐受型枯草芽孢杆菌的筛选分别取1ml所述枯草芽孢杆菌的新鲜培养液接种至ph＝2.5和含0.3％猪胆盐的无菌pbs中，于37℃条件下分别培养3h后，取样并连续稀释至10-4、10-5，吸取0.1ml稀释液涂布于na平板上，37℃培养12h后计数测定活菌数，以0h活菌数为对照，计算存活率。耐受性试验结果表明，在受试的枯草芽孢杆菌中，仅有18％的受试样对酸和胆盐极敏感，存活率低于30％；其余的均能同时耐受ph＝2.5和0.3％胆盐的环境，存活率高于80％。2.2抑菌型枯草芽孢杆菌的筛选将活化后的上述菌株菌液于4℃，6000r/min条件下离心10min，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后4℃保存，备用；选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等10株常见致病菌作为指示菌，将活化后的致病菌用无菌pbs调节成浓度为106cfu/ml的菌悬液，用无菌棉棒蘸取后均匀涂布于固体平板上。采用牛津杯法测定菌株的抑菌活力。在牛津杯中加入150μl上述无菌上清液后，于室温下预扩散2h，置于培养箱中37℃培养18h后，用游标卡尺测量抑菌圈大小并评价抑菌效果。结果表明，仅有34％的受试样品对任何致病菌未产生抑制生长作用，其余受试样品均对10株常见致病菌有不同程度的抑制作用。其中枯草芽孢杆菌bsc16a抑菌效果如表1所示，该菌株可抑制大肠杆菌(图4)、单增李斯特氏菌、普通变形杆菌等多种病原菌的生长，对产气荚膜梭菌有极强的抑制作用，抑菌圈直径达26.25mm，对金黄色葡萄球菌atcc6538的抑制作用如图5所示，bsc16a不抑制沙门氏菌bsc的增长。表1枯草芽孢杆菌bsc16a抑菌能力测定(mm)2.3高黏附性枯草芽孢杆菌的筛选荧光标记枯草芽孢杆菌：活化后的上述枯草芽孢杆菌菌液于4℃，6000r/min条件下离心并收集菌体；用无菌pbs洗涤3次后，加入到工作浓度为500μg/ml的异硫氰酸荧光素(fitc)标记液中；涡旋混匀后于37℃条件下暗孵育2h；6000r/min离心标记后的菌液，并用pbs洗涤3次去除未结合的fitc；将菌体重悬于rpmi-1640细胞培养液中，调整菌体浓度为2×108cfu/ml；吸取100μl荧光标记后的菌液于96孔板中，用酶标仪测定其在吸收光波长为485nm及发射光波长为530nm时的相对荧光强度，即为初始相对荧光值。本发明上述异硫氰酸荧光素(fitc)标记液的配制(1ml)：取出4℃保存的fitc在室温条件下放置30min，称取0.5gfitc溶于1ml二甲基亚砜(dmso)中，即配成500mg/ml的溶液；吸取1μl上述溶液加入到999μl无菌pbs中，即工作浓度为500μg/ml的荧光标记液。caco-2细胞的培养：从液氮罐取出1支冻存的caco-2细胞，于37℃水浴迅速融化；吸取冻存管中的细胞到15ml离心管中，并添加5ml细胞培养液混匀；于1000r/min条件下水平离心15min；离心后弃上清，用6ml添加有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的细胞培养液重悬细胞，并置于37℃、含5％co2的培养箱中培养；细胞培养24h后弃去瓶内液体，用无菌pbs漂洗贴壁生长的细胞并补足细胞培养液；持续培养48h后，弃去瓶内液体；用无菌pbs漂洗细胞后，吸取0.6ml胰酶在37℃条件下消化细胞2min；用移液枪反复吹打细胞至细胞呈单个分散状态；以1:6比例进行细胞传代后，继续培养细胞；细胞传代数次，待细胞状态良好时，将新鲜传代的细胞分装于12孔培养板中培养。黏附试验：分别向培养至单层细胞的12孔培养板中加入0.5mlfitc标记的上述枯草芽孢杆菌，于37℃、5％co2培养箱中封闭孵育2h后，用无菌pbs漂洗3-5次去除未黏附的细菌；移取300μl胰酶消化细胞5min，显微镜下细胞呈雪花状散落时加入细胞培养液终止反应。吸取100μl细胞悬液于96孔板中并测定荧光强度，记录为黏附后相对荧光值。菌株的黏附率计算公式为：黏附率＝(黏附后相对荧光值/初始相对荧光值)×100％黏附试验结果表明，上述100株枯草芽孢杆菌中，91％的菌株对caco-2细胞的黏附率低于10％，最低黏附率仅为1.08％，仅有9株枯草芽孢杆菌对caco-2细胞的黏附率高于10％，其中枯草芽孢杆菌bsc16a黏附率最高，为10.92％。表2枯草芽孢杆菌bsc16a黏附率菌株黏附率(％)枯草芽孢杆菌bsc16a10.92±0.71因此，筛选出枯草芽孢杆菌bsc16a作为益生菌。实施例三枯草芽孢杆菌bsc16a的的生物学特性研究3.1枯草芽孢杆菌bsc16a的活化及其种液制备从-20℃冰箱中取出冻存的枯草芽孢杆菌bsc16a于37℃水浴中迅速融化并在na平板上划线，37℃培养10h后挑取单菌落接种于10ml的营养肉汤培养基中，37℃、220rpm/min振荡培养18h。连续传代两次后制成种液，备用。3.2枯草芽孢杆菌bsc16a生长曲线的测定取3.1中枯草芽孢杆菌bsc16a种液，以2％接种量接种于营养肉汤培养基中，37℃振荡培养24h。以未接菌的液体培养基为对照，分别在接种后每间隔2h取样测定菌液od600值。结果如图6所示，接种2h后枯草芽孢杆菌bsc16a进入对数生长期，接种10h后，菌体进入生长稳定期，此时菌体浓度最高、活性最佳，其od600为3.55。3.3芽孢杆菌酸和胆盐耐受性测定取1ml上述新分离株的种液加入到9ml不同ph值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)或含不同浓度猪胆盐(0.0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.6％)的的pbs中，于37℃分别培养0、2、4h，取样后稀释至10-4、10-5并涂布于na平板上，37℃培养10h后计数。菌株bsc16a在酸和胆盐环境中的存活率见表3，菌株bsc16a在ph＝3.0及以上条件下分别耐受2h、4h后，存活率高于75.00％，在ph＝2.5及以下的环境中存活率较低。枯草芽孢杆菌bsc16a在不同胆盐条件下均能生长，但对胆盐浓度为0.6％的环境耐受性较差。表3枯草芽孢杆菌bsc16a在酸和胆盐环境中的存活率ph梯度ph＝2.0ph＝2.5ph＝3.0ph＝3.5ph＝4.02h20.14％57.19％89.04％98.94％100.00％4h1.05％38.23％75.00％79.48％84.78％胆盐浓度0.0％0.1％0.2％0.3％0.6％2h96.16％90.57％86.32％77.13％55.00％4h90.16％87.14％70.15％58.12％30.14％3.4枯草芽孢杆菌bsc16a在模拟胃肠道溶液中的耐受性测定模拟胃液：称取胃蛋白酶(1:15000)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，调节ph至3.0)中，配制成浓度为3g/l的溶液。0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存。模拟肠液：称取胰蛋白酶(1:250)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，调节ph至8.0)中，配制成浓度为1g/l的溶液，加入0.3％胆盐。0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存。菌株bsc16a过夜培养后，离心并用无菌的pbs重悬，调节浓度为1×109cfu/ml。取1ml上述菌液加入到9ml模拟胃液中，37℃培养1、2、3h，分别取样并计数。3h后，取1ml上述液体加入到模拟肠液中，37℃培养2、4、6h后，分别取样并计数。bsc16a的耐受性结果见表4，经过模拟胃液处理3h以及模拟肠液处理6h后，菌株bsc16a的存活率仍在88％以上，可知该菌对胃肠道环境有很好的耐受性。表4枯草芽孢杆菌bsc16a在胃肠道溶液中的耐受性检测[(x±s)×107cfu/ml]3.5枯草芽孢杆菌bsc16a产蛋白酶和淀粉酶能力测定蛋白水解试验琼脂平板：称取脱脂奶粉50g，琼脂15g，加入到1l水中，于113～115℃灭菌20min。淀粉水解试验琼脂平板：称取牛肉膏5g，蛋白胨10g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，加入到水1l水中，调节ph为7.2～7.6，于113～115℃灭菌20min。将活化后的bsc16a菌液于4℃，6000r/min离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤，上清液4℃保存备用；用牛津杯分别在上述两种琼脂平板上均匀打孔；吸取150μlbsc16a的无细胞发酵上清液加入到孔中，于37℃恒温培养，分别于3h、6h、9h、12h和24h时测量水解圈的直径。如表5所示，bsc16a有极高的产蛋白酶和淀粉酶能力，将其应用于饲料添加剂中，在一定程度上有分解营养物质，促进营养吸收的作用。菌株bsc16a蛋白水解能力如图7所示。表5枯草芽孢杆菌bsc16a水解环直径随时间变化结果(mm)3h6h9h12h24h蛋白水解环13.6514.5316.3218.4420.04淀粉水解环10.3312.5713.2915.8718.63实施例四枯草芽孢杆菌bsc16a在提高育肥猪生长性能和机体免疫方面的应用4.1动物饲养管理选择日龄相近、体重相近的健康育肥猪30头，随机分为试验组和对照组并编号，每组15头。对照组饲喂正常饲料，试验组饲料在对照组基础上添加枯草芽孢杆菌bsc16a(2×108cfu/ml/头/天)。试验期为60d。4.2提高生长性能的研究在饲喂试验第0d、30d和60d分别称量每只猪的体重并记录。由表6可知，试验初期，试验组和对照组初始体重无明显差异，饲喂30d和60d后，与对照组相比，试验组平均体重和平均日增重均高于对照组，表明菌株bsc16a有提高育肥猪生长性能的作用。表6枯草芽孢杆菌bsc16a对育肥猪体重的影响试验组对照组0d体重(kg)36.41±2.0335.77±1.1830d体重(kg)59.81±1.6957.37±1.1730d平均日增重(kg)0.78±0.160.72±0.0660d体重(kg)82.61±1.9977.17±2.2560d平均日增重(kg)0.77±0.060.69±0.154.3提高机体免疫功能的研究在饲喂试验结束后采集每只猪的血液样品，并于室温下静置2h后3500r/min离心15min收集上清，血清样品于-20℃保存。用elasa酶联免疫试剂盒检测血清中iga、igm、igg、ifn-γ和il-2的含量。枯草芽孢杆菌bsc16a对育肥猪免疫功能的影响如表7所示，在三种检测的免疫球蛋白和两种免疫细胞因子中，与对照组相比，试验组除iga基本无变化外，其余四种免疫指标在变化明显，表明本发明枯草芽孢杆菌可提高血清中igg、igm、ifn-γ及il-2的分泌水平。表7枯草芽孢杆菌bsc16a对育肥猪免疫功能的影响igg(μg/ml)igm(μg/ml)iga(μg/ml)ifn-γ(pg/ml)il-2(pg/ml)对照组429.55144.96104.79382.61132.63试验组527.45184.49106.28469.59193.214.4对消化道微生物的影响试验结束后从两组试验猪中随机选择一头猪，分别用无菌小勺采集新鲜粪便样品并保存。称取1g粪样后与9ml无菌pbs混合并涡旋混匀，梯度稀释。取1ml稀释液于80℃加热处理10min，将稀释至10-3-10-5浓度的稀释液涂布于na平板上，37℃培养12h后计数芽孢杆菌的数量；将稀释液涂布于mrs固体平板上，37℃厌氧培养24h后计数乳酸菌的数量；将稀释液涂布于麦康凯固体平板上，37℃培养18h后计数粪样中大肠杆菌的数量。本发明上述使用的mrs固体平板配方如下：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0ml，k2hpo4·3h2o2.0g，无水乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，mgso4·7h2o0.29g，mnso4·h2o0.058g，琼脂15g。将上述成分加入蒸馏水中，定容至1l，于121℃高压灭菌20min。本发明上述使用的麦康凯固体平板配方如下：蛋白胨20.0g，乳糖10.0g，牛胆盐5.0g，氯化钠5.0g，中性红0.075g，琼脂15.0g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1l，调节ph为7.2±0.2，于121℃高压灭菌20min。饲喂枯草芽孢杆菌bsc16a后对粪便中微生物的影响如表8所示，试验组粪便中芽孢杆菌含量略高于对照组，乳酸菌含量上升，大肠杆菌含量下降。表8饲喂枯草芽孢杆菌bsc16a对猪粪便中微生物的影响(lgcfu/g)芽孢杆菌乳酸菌大肠杆菌对照组4.976.057.05试验组5.186.426.49实施例五枯草芽孢杆菌bsc16a在防治幼畜腹泻中的应用将本发明枯草芽孢杆菌bsc16a与实验室自分离约氏乳杆菌ghz10a及唾液乳杆菌zlp4b按一定比例配伍成复合微生态制剂，初步应用于仔猪腹泻病的防治中。结果如表9所示，分别饲喂甘肃永靖、平凉、民乐、陕西杨凌和河南明权5个养殖场共计1511头腹泻仔猪，饲喂第二天，腹泻症状明显缓解，饲喂3天后，80％的病畜不再发生腹泻症状，持续饲喂3-5天后，病畜基本痊愈，饲喂期间甘肃平凉养殖场无动物死亡发生，治愈率达100％，其余养殖场中有个别病畜因腹泻严重及其他因素导致死亡，其中甘肃民乐养殖场中有5头猪因脱水严重而死亡。除陕西杨凌养殖场中仔猪腹泻治愈率为87.60％外，其余养殖场中腹泻病例治愈率均高于90.00％。上述饲喂试验中，益生菌制剂在对仔猪腹泻治愈效果显著，且未出现病情反复等现象。此外，将上述复合微生态制剂初步应用于腹泻羔羊和犊牛中，均有缓解并治愈腹泻病的效果。因此，本发明枯草芽孢杆菌bsc16a可作为复合微生态制剂复配菌株应用于幼畜腹泻病防治中。表92019年仔猪腹泻病例防治结果统计表地区动物养殖规模发病数康复数死亡数治愈率死亡率甘肃永靖仔猪20003263022092.63％6.67％甘肃平凉仔猪60056560100.00％0.00％甘肃民乐仔猪80005324963693.23％7.67％陕西杨凌仔猪4000121106+14*387.60％2.47％河南明权仔猪60004764522494.96％5.04％备注：其中14头灌服3天发现没有明显改善，后与抗生素联合治疗，其中11头康复，3头死亡。但在统计中，没有按照康复猪数目计算。当前第1页12