一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记C7及其应用的制作方法

本发明属于dna分子标记技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7及其应用。

背景技术：

三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)属甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，俗称梭子蟹，是我国重要的大型海洋经济蟹类。梭子蟹肉质鲜美、营养丰富，在国内外享有盛名，深受消费者喜爱。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，该菌存活能力强，在海水中可存活47天。若人类食用了含有副溶血性弧菌的海产品，会引起急性疾病、腹痛、呕吐、腹泻等症状。耐副溶血弧菌性状是三疣梭子蟹重要的选育性状之一，对于提高梭子蟹的成活率以及预防食物中毒具有重要意义。然而副溶血弧菌具有耐受性广，繁殖周期快的特点，如果通过传统的育种方法进行选育，则进展过于缓慢，因此急需借助分子标记辅助育种技术来加快选育进程。

分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是dna水平遗传多态性的直接的反映。分子标记具有显著的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；生物发育不同阶段、不同组织的dna都可用于标记分析；分子标记检测手段简单、迅速。目前，有关三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记还未见报道，因此，开发耐副溶血弧菌的分子标记对三疣梭子蟹的健康养殖及育种具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7及其应用，本发明利用测序数据的多态性位点过滤及比对分析、pcr测序的方法，得到snp和indel标记，再经过对标记进行逐步的筛选和验证，最终获得一个新的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7，有利于三疣梭子蟹耐受副溶血弧菌性状的筛选和选育。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7，所述分子标记c3的核苷酸序列如seqidno.2所示。

进一步的，所述分子标记c7为snp标记。

进一步的，所述分子标记c7的副溶血弧菌耐受基因型为tt基因型。

本发明还提供了用于检测权利要求1所述的分子标记c7的引物对，其特征在于，所述引物中的正向引物的核苷酸序列如seqidno.2，反向引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明还提供了所述的分子标记c7在筛选三疣梭子蟹耐受副溶血弧菌性状品种中的应用。

本发明还提供了所述的分子标记c7在三疣梭子蟹遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供的三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7可以不受三疣梭子蟹生长阶段的限制，能够用于三疣梭子蟹早期蟹苗选育，进而明显促进三疣梭子蟹的选育进程，加快选育优良性状的速度。

2、利用本发明提供的分子标记c7检测三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的性状，方法准确可靠、操作简单，能够有效、快速的筛选出符合要求的性状，辅助早期育种，实现短时间、低成本的选育出耐副溶血弧菌的三疣梭子蟹的品种，增加优良品质的三疣梭子蟹数量，减少感染几率，提高产量，促进三疣梭子蟹的健康繁殖，进而还可以减少食用海产品的中毒反应，对三疣梭子蟹的健康养殖与发展具有重要的意义，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中混合模板pcr产物的凝胶电泳条带结果。

图2为本发明中敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异结果，其中1为敏感群体混合模板，2为耐感群体混合模板。

图3为本发明以筛选的敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异明显的引物进行pcr扩增后产物的凝胶电泳条带结果。

图4为本发明中c7分子标记部分测序结果，其中1为tt基因型，2为aa基因型，3为ta基因型。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

本发明所用的三疣梭子蟹均来自中国水产科学研究院黄海水产研究所昌邑海丰水产有限公司实验基地，通过拖网捕捞的方法随机从池塘中获得健康活泼的三疣梭子蟹，短暂安置于网筐之中并铺上一层水草以防止螃蟹斗殴，最后获得体重35±3g的三疣梭子蟹300只，放置于4个养殖池(500cm×300cm×150cm)中暂养7d，暂养期间水温保持在22±1℃，加水至20cm，盐度33，ph8.2±0.5，持续供氧，每天早上8点更换新鲜海水，下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹总重量的1/3。7d后挑选活力、形态较好的梭子蟹进行后续实验。

正式实验时把活力旺、体表完好的螃蟹放置于4个水泥池中，每池50只螃蟹，此时水体ph为7.9±0.5，水温保持在22±1℃，水深20cm。然后于梭子蟹游泳足的第一基节膜处注射100μl的副溶血弧菌(浓度为2.26×10⁷cfu/ml)。每天下午5点投喂新鲜杂鱼，喂食量约为螃蟹重量的1/4，保证池底无大量饵料残留影响水质。前48h每隔3h记录一下螃蟹的死亡时间和数量，48h后，对幸存的梭子蟹再次注射100μl的副溶血弧菌(浓度为5.3×10⁷cfu/ml)；此时水体的ph为8.0±0.5，水温保持在22±1℃；继续每隔3h记录一次死亡时间和数量，直至4个池中幸存螃蟹数量为20只时停止实验。最先死亡的20个螃蟹个体为副溶血弧菌感染敏感组，最后存活的20个螃蟹个体为副溶血弧菌感染耐受组，解剖螃蟹取肌肉组织于冻存管中，放于液氮保存。

实施例1

一、耐副溶血弧菌性状相关候选分子标记筛选

1、测序数据过滤和比对

采用全式金公司的试剂盒进行dna的提取，利用硅胶膜离心柱特异吸附dna原理进行dna提取。首先，将大约30mg的组织样品放到1.5ml的无菌酶离心管，加入200μllysisbuffer8(lb8)和20μlrnasea(10mg/ml)，振荡10s左右的时间，室温条件下孵育2min，加入20μlproteinasek(20mg/ml)，充分振荡混匀，55℃孵育至完全裂解，加入1.5倍体积的bindingbuffer8(bb8)，混匀后加入离心柱中，在高速低温冷冻离心机(型号为eppendorf5804r)中12000rpm离心30s，弃废液。然后加入500μl的cleanbuffer8(cb8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，再加入500μl的washbuffer8(wb8)，12000rpm离心30s，弃废液(重复一次)，12000rpm空离2min，以彻底除去残留的wb8。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中心加入50微升elutionbuffer(eb)，室温静置2min，12000rpm离心1min，洗脱dna。通过琼脂糖凝胶电泳分析dna的纯度和完整性；利用nanodrop检测dna的纯度(od260/280比值)，利用qubit对dna浓度进行精确定量。

将检验合格的dna样品等量混合为两个混合池，分别命名为副溶血弧菌敏感dna混合池(cg)和耐副溶血弧菌dna混合池(ct)。混合dna样品通过covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段，采用truseqlibraryconstructionkit进行建库，dna片段经末端修复、加ploya尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过illuminahiseqpe150进行测序。对测序得到的rawreads进行过滤，得到cleanreads，用于后续分析，测序数据结果见表1。

表1测序数据质量汇总

过滤后的有效数据通过burrows-wheeleralignmenttool(bwa)软件进行比对，比对结果经samtools去除重复。比对结果表明所有样本的比对率在85％以上，平均测序深度在25x以上，可用于后续分析。

2、标记检测及注释

通过genomeanalysistoolkit3.8(gatk)软件中的unifiedgenotyper模块进行检测snp和indel，snp过滤参数设置为：mq＜40，qd＜4，fs＞60；indel过滤参数设置为qd＜4，fs＞200，最终获得的snp和indel标记总数为515,019个。

3、snp和indel频率差异分析

分别分析计算两组个体在每个位点的snp-index和indel-index，并对多态性位点进行过滤，过滤标准如下：

(1)两组个体中snp/indel-index频率都小于0.3；

(2)过滤掉一个个体中snp/indel缺失的位点。

同时计算snp和indel的频率差异分布，方向如下：δ(index)＝index(耐副溶血弧菌性状)-index(副溶血弧菌敏感性状)，过滤掉δindex小于0.3的位点，最后得到组间差异的snp270个，indel183个，上述均为耐副溶血弧菌相关候选分子标记，候选snp和indel的结果统计如表2所示。

表2snps和indel检测与注释统计结果

4、标记筛选

对候选的snp和indel标记进行筛选，挑选个体中all-index接近0的位点或者挑选个体中all-index接近1的位点作为下一步验证的优先选择位点。筛选标准如下：

(1)根据snp位点的注释信息，在根据δindex进行从高到低排序的基础上，优先选择同义、非同义突变或者上下游区域的位点；

(2)根据indel位点的注释信息，在根据δindex进行从高到低排序的基础上，优先选择插入或缺失碱基大于5个的位点。

最终筛选出副溶血弧菌胁迫前后频率差异较大的标记，共筛选出55个snp标记和60个indel标记。

二、耐副溶血弧菌相关分子标记验证

采用pcr产物测序的方法在cg和ct群体里对耐副溶血弧菌性状相关候选分子标记进行验证：

(1)首先在标记位点侧翼序列设计引物，其中至少有一条引物距离标记位点70bp以上；

(2)利用设计好的引物分别以cg和ct混合dna材料为模板进行pcr扩增，并将成功扩增的pcr产物进行测序，测序引物选择离标记位点较远的引物；

(3)利用contigexpress软件分析测序峰图，挑选cg和ct两组在对应位置测序峰图有较大差异的标记继续进行个体dna模板的pcr扩增和测序分析；

(4)根据测序结果统计每个个体的基因型，并通过spss软件分析标记与耐副溶血弧菌性状是否相关。

具体的操作步骤如下：

1、pcr扩增

本发明中的pcr体系为：模板1μl，正向引物(10μm)0.2μl，反向引物(10μm)0.2μl，buffer缓冲液1μl，dntps0.8μl，hifi0.2μl，ddh2o6.6μl。

按照上述体系加入样品后，再按照如下的反应条件进行pcr扩增：预变性94℃5mia；变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃1min，共重复35个循环；最后延伸72℃10min；4℃保存。

2、电泳检测

用琼脂糖配置1％的电泳胶，将一定量比的琼脂糖和tae混合后放在微波炉里加热至溶解为无色透明液体，倒入制胶模具中并插入梳子，静置20min凝固后拔出梳子，把制好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，点样孔位于负极，以浓度为0.5％的tae为缓冲液，选用genegreen为核酸染色剂，将混合模板的pcr产物用移液枪吸出3ul点到样孔中，然后将电压和电流分别调至120v、60ma，设定时间为30min进行凝胶电泳，待到染色区条带到达凝胶2/3处时停止，电泳结束后用凝胶成像系统观察并拍照记录，挑选明亮且条带单一的样品送置生工进行dna测序，对返回的测序结果进行数据图像分析，选择其中两组对应位置测序差异明显的标记进行个体的pcr扩增，同样将扩增产物进行凝胶电泳，并对pcr产物进行测序。

3、统计分析

根据混合模板pcr产物的凝胶电泳条带的位置和亮度选取出符合要求的条带(如图1)，共选择出23对snp引物和10对indel引物进行测序分析。

利用contigexpress软件分析测序峰图，选择敏感群体混合模板和耐感群体混合模板两组对应位置差异明显的引物(如图2)，并继续用该引物，以个体为模板进行pcr扩增，扩增条件保持不变，然后挑选大小符合且明亮的条带送去测序，测序结果如图3所示，个别扩增效果不佳的条带重新进行扩增来补足，共选择出15个snp标记和3个indel标记。

再将返回的个体测序结果用contigexpress软件进行观察并将基因型信息导入spss软件，利用卡方检验计算p值，选出p＜0.01标记，最后共选择出3个snp标记和1个indel标记。

根据表3所示，可以看出在c7_4587668(简称c7)中基因型tt在存活组中(耐感群体)占比95％以上，基因型aa只有5％；而在早期死亡个体(敏感群体)中基因型aa和tt的个体分别占42％和37％；该组数据p＝0.001，具有极显著差异性，因此可认为在该位点基因型tt为副溶血弧菌耐受基因型。c7分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示，部分测序结果如图4所示，其中开发该分子标记的扩增引物如seqidno.2和seqidno.3所示(表4)。

表3c7分子标记的基因型结果

表4分子标记的扩增引物

本发明获得的分子标记c7能够用来辅助选育三疣梭子蟹耐副溶血弧菌品种，应用步骤简单来说为：提取三疣梭子蟹测试样品的dna并将其作为模板，使用分子标记c7的扩增引物c7-f和c7-r进行pcr扩增，并将pcr产物进行测序，如果测序结果中c7的基因型为tt，则测试样品可以选择作为培育三疣梭子蟹耐副溶血弧菌品种的亲本。另外，分子标记c7还能够用来分析三疣梭子蟹遗传的多样性、种质鉴定以及构建三疣梭子蟹的遗传图谱。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>一种三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子标记c7及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>601

<212>dna

<213>三疣梭子蟹(portunustrituberculatus)

<400>1

attacttttctctatctaactttactatatcctttctattcctccctgcaacttctcctt60

cctcttttcgttcatgttttccctcttttccttcccctattttctcacttcacttcgcta120

tcaaaacgttacttttctccttatctacttcaccccctcttcttatccaccacatacaca180

gccacacatgcacactctccctaaccacaccctgttatctttctcttcctctccctttct240

catcatcttacttttctccttatccacctcactccctctcatccaacatacacacactat300

tgtctctttttccctctcctcacctcactcattttcaaaccttacttttcccttatccac360

ttcactccctcctatcatccaccacacatacattcacacatgcacactttccctaaccac420

acccctccacctctccaccagatcgcccgcaactcgttggtggagctgcgcaagtggatc480

actaccgtcacctcgctgccagaccgccacttcttgcccgaggaagtggagaaggtgaca540

gctgcctctctggtccgctctgacgaagacctcacgctggagtcactgctgaggagcctg600

g601

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctccctttctcatcatcttacctt24

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtggtggatgataggaggg20