抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、其所分泌的单克隆抗体、该单克隆抗体的可变区序列、分泌其的杂交瘤细胞株，以及使用该单克隆抗体制备的试剂盒和应用，属于含有抗体的医药配制品和免疫测定法领域。
背景技术：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物易患的一种热性、急性、高度接触性传染病。该病传播迅速，发病率高，该病的爆发和流行给全球养殖业带来了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(oie)和联合国粮农组织(fao)将其列为a类烈性传染病之首，我国将其列为一类传染病第一位。目前对口蹄疫的防控主要是疫苗免疫为主，对疫苗免疫后抗体水平的监测是控制疫苗免疫效果的必要措施。口蹄疫有7个血清型和80多个亚型，极易发生变异，由于型与型之间无交叉免疫保护作用，同一血清型内的不同亚型的抗原性皆有不同程度的差别，血清学交叉反应的程度也各不相同,这就要求检测方法必须特异和稳定。市场上常用的口蹄疫血清学检测方法：病毒中和试验(vnt)和液相阻断elisa方法(lpb-elisa)。病毒中和试验是抗体测定的金标准，但该方法需要动用活毒，且只能在特定的实验室中才能操作，操作相对复杂且存在生物安全风险。液相阻断elisa试剂盒操作步骤繁琐，且试剂盒批次间检测结果不稳定。近几年来，继o型口蹄疫之后，a型口蹄疫开始流行和暴发，国内市场上对免疫后抗体监测应用较多的是口蹄疫a型病毒抗体液相阻断elisa试剂盒，但该试剂盒的捕获抗体和酶标抗体使用的都是多抗，多抗血清经常出现品质不均匀，影响检测结果。而单克隆抗体生物活性单一，易于生产和标准化，因此筛选合适的a型口蹄疫病毒的单克隆抗体制备elisa试剂盒，解决稳定性差的问题，提高了敏感性和特异性，对于该病的诊断和预防具有重要意义。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明提供了两株杂交瘤细胞株、及其所产生的抗口蹄疫病毒a型单克隆抗体在制备口蹄疫病毒a型抗体固相竞争elisa检测试剂盒中的应用。本发明涉及一种特异性结合a型口蹄疫病毒的单克隆抗体2e11的可变区序列，其中，所述单克隆抗体2e11的可变区序列包括重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体2e11重链可变区的基因如seq.idno.1或其简并序列所示或所述单克隆抗体2e11重链可变区为seq.idno.1或其简并序列编码的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述单克隆抗体2e11轻链可变区的基因如seq.idno.2或其简并序列所示或所述单克隆抗体2e11轻链可变区为seq.idno.2或其简并序列编码的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。单克隆抗体2e11的可变区序列具有强的与a型口蹄疫病毒特异性结合的能力。本发明还涉及一种抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有所述的单克隆抗体2e11的可变区序列，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合a型口蹄疫病毒的能力。作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体2e11。本发明的单克隆抗体2e11的elisa效价为1:5760。本发明涉及一种杂交瘤细胞2e11株，其中，所述杂交瘤细胞2e11株分泌所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段为所述单克隆抗体2e11。杂交瘤细胞2e11株能有效分泌单克隆抗体2e11，分泌的单克隆抗体2e11纯度高。本发明涉及一种特异性结合a型口蹄疫病毒的单克隆抗体3b4的可变区序列，其中，所述单克隆抗体3b4的可变区序列包括重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体3b4重链可变区的基因如seq.idno.3或其简并序列所示或所述单克隆抗体3b4重链可变区为seq.idno.3或其简并序列编码的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述单克隆抗体3b4轻链可变区的基因如seq.idno.4或其简并序列所示或所述单克隆抗体3b4轻链可变区为seq.idno.4或其简并序列编码的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。单克隆抗体3b4的可变区序列具有强的与a型口蹄疫病毒特异性结合的能力。本发明还涉及一种特异性结合a型口蹄疫病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段具有所述的单克隆抗体3b4的可变区序列，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合a型口蹄疫病毒的能力。作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体3b4。本发明的单克隆抗体3b4的elisa效价为1:11520。本发明还涉及一种杂交瘤细胞3b4株，其中，所述杂交瘤细胞3b4株分泌所述的抗体或抗体片段，所述抗体为所述单克隆抗体3b4。本发明还涉及一种a型口蹄疫病毒固相竞争elisa检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的单克隆抗体2e11、有效量的a型口蹄疫病毒抗原、有效量的酶标记的单克隆抗体3b4，对a型口蹄疫病毒抗原抗体反应进行检测的检测试剂，支持介质，所述单克隆抗体2e11包被在支持介质上。本发明的固相竞争elisa检测试剂盒，解决了目前液相阻断elisa试剂盒批次间差异较大，稳定性差的问题。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的检测试剂盒中，所述单克隆抗体2e11含量为6～15μg/ml，所述a型口蹄疫病毒抗原含量为50～400μg/ml，所述单克隆抗体3b4含量为10～18μg/ml，所述支持介质为微滴定板。本发明试剂盒检测滴度稀释的阳性血清，检测效价达到1:128，本发明的固相阻断elisa试剂盒灵敏度较高。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的检测试剂盒中，所述单克隆抗体2e11含量为10μg/ml，所述a型口蹄疫病毒抗原含量为200μg/ml，所述单克隆抗体3b4含量为12μg/ml。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的检测试剂盒中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照；所述样品稀释液为含有脱脂奶的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液为含有tween-20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液，ph值为7.4，其1l体积配方为：nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g；所述显色液包括显色液a和显色液b，所述显色液a含tmb20mg、无水乙醇10ml，并用ddh2o定容至100ml；所述显色液b含柠檬酸2.1g、无水na2hpo42.82g、0.75％(v/v)的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddh2o定容至100ml；所述终止液为2mol/lh2so4。作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的检测试剂盒中，所述样品稀释液为含有10％(w/v)脱脂奶的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液为含有0.05％(v/v)tween-20的磷酸盐缓冲液；所述阳性对照为a型口蹄疫病毒抗原的高免血清，所述阴性对照为无口蹄疫抗体的猪血清。术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想ph值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的ph值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明。术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如igg，ige，igm，igd和iga)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如fab、scfv、fv、dab、fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在ep.a.0120694和ep.a.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用dna重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(cdrs)的dna引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见ep.a.184187，gb2188638a或ep.a.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的dna序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用pcr法扩增得到，因而也可用重组dna方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链n末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链n末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与o型口蹄疫特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。术语“有效量”当理解为“检测有效量”时，是指能够以高灵敏度检测出阳性样本，并可区分出阴性样本的量。本发明实施例中所用到的抗原为口蹄疫a型病毒样颗粒(公开于中国专利cn105566449a)。实施例1杂交瘤细胞的获得1小鼠免疫以口蹄疫a型病毒样颗粒蛋白作为免疫原，免疫5～6周龄balb/c小鼠，免疫方式为背部皮下多点注射，每只注射量为150μg。首免使用弗式完全佐剂，之后加强免疫使用弗式不完全佐剂，每次免疫时间间隔为两周，三免后1周采集小鼠血清，检测抗体效价(兰兽研液相阻断elisa试剂盒)，当抗体效价不低于1:1440时，进行冲击免疫，即尾静脉注射抗原，冲击免疫后三天，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞融合。2细胞融合无菌条件下取得小鼠脾脏，置于无菌200目筛网上研磨，获得脾细胞悬液，与骨髓瘤细胞按照10:1的比例混合，在37℃条件下，1分钟内加入1mlpeg1500，作用1分钟后，加入1ml37℃预热的dmem培养液终止反应，1分钟内加完，作用1分钟，如此共加5次(整个融合过程需晃动融合管)，补加预热的dmem培养液至20ml，37℃作用15分钟后，800rpm离心7min；弃去上清，用胎牛血清培养液(加hat选择培养基)重悬；将上述细胞加入96孔板中，每孔50μl；将培养板置于37℃5％co2培养箱中培养。第3天和第6天用20％胎牛血清培养液(加hat选择培养基)进行半换液，观察杂交瘤细胞生长至孔底约1/5时，取上清检测特异性抗体。3.筛选杂交瘤细胞按照兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒说明书，将检测为阳性的杂交瘤细胞用20％胎牛血清培养液(加ht选择培养基，sigma)，计数，调整细胞为3～5个细胞/ml，每孔滴加100μl稀释后的细胞，后每孔补加100μlht选择培养基，置于37℃5％co2培养箱中；在第3天和第6天进行半换液20％胎牛血清培养液(加ht选择培养基，sigma)，观察细胞克隆形成情况，及时检测抗体活性。亚克隆获得阳性单克隆细胞后，将其传代扩大培养，并以2×106个细胞/支于液氮中保存。最终筛选出八株杂交瘤细胞，分别命名为杂交瘤细胞1～8。实施例2单克隆抗体的制备和鉴定1单克隆抗体腹水的制备用灭菌液体石蜡致敏7～8周龄balb/c小鼠，0.5ml/只，10天～18天内向腹腔注入0.5ml(约2.0×106个细胞/ml)的杂交瘤细胞。注射后每天轻揉小鼠腹部，至小鼠腹部明显横向涨大时抽取腹水。将腹水10000rpm离心10min，取上清，分装，-70℃保存。2杂交瘤细胞腹水效价测定按照兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒说明书，分别测定制备的单克隆抗体1～8的抗体效价，分别为1:5760、1:5760、1:8192、1:2880、1:4096、1:5760、1:4096和1:11520。证明单克隆抗体1～8与病毒反应性均良好，可用于开发诊断试剂使用。实施例3单克隆抗体的纯化和含量测定采用亲和层析进行杂交瘤细胞小鼠腹水的纯化，具体操作如下：将冻存的腹水样品解冻，10000rpm4℃离心10min,吸取澄清液体，用3倍柱体积的上样缓冲液(bindingbuffer配方：20mmna2hpo4，0.15mnacl，ph8.0)稀释后，进行proteing亲和层析柱纯化，柱层析洗脱液为ph2.50.1m的甘氨酸缓冲液，洗脱下来的抗体需立即用中和缓冲液(1mtris-hcl，ph8.5)调整ph值至中性，并进行sds-page胶分析和蛋白含量测定，结果显示：纯化后的单克隆抗体1～8纯度均大于90％，蛋白含量分别为3.3mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.5mg/ml、3.3mg/ml和3.9mg/ml，可满足临床应用的需求。实施例4单克隆抗体的标记和配对检测1.单克隆抗体的辣根过氧化酶(hrp)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶的标记，具体操作如下：称取2mghrp溶解于0.5ml三蒸水中；于上液中加入0.5ml新配制的0.06mol/lnaio4溶液，4℃避光作用30min；上液中加入160mmol/l的乙二醇0.5ml，室温作用30min；上液中加入口蹄疫a型单克隆抗体2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000ml的0.05mmol/l碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；透析液吸至10ml的离心管中，加0.25ml新配的5g/lnabh4液，混匀后置4℃2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min，在4℃下3000r/min离心25min，弃上清；将沉淀溶于1.5ml0.02mol/lph7.4pbs中，吸入透析袋内，在0.02mol/lph7.4pbs中透析，4℃过夜；将透析液中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用。2.配对抗体活性检测选择a型口蹄疫病毒阳性血清，对于不同搭配模式进行检测，结果见表1。表1单克隆抗体搭配活性检测注：+表示阳性，-表示阴性结果显示，包被单抗1/标记单抗2、3、4、6、7检测阴性；包被单抗2/标记单抗1、3、4、8检测阴性；包被单抗3/标记单抗1、2、4、6、7、8检测阴性；包被单抗4/标记单抗1、2、3、4、5、6、7、8检测阴性；包被单抗5/标记单抗1、2、3、6、7、8检测阴性；包被单抗6/标记单抗4检测阴性；包被单抗7/标记单抗1、2、3、4、6、8检测阴性；包被单抗8/标记单抗2、3、4检测阴性；其他搭配均为阳性。3.配对抗体的非特异性检测选择o型口蹄疫病毒阳性血清，对上述检测为阳性的搭配模式进行检测，结果显示单抗6包被与单抗8标记未出现非特异性反应。最终筛选出的两株单抗单克隆抗体6和单克隆抗体8分别命名为2e11、3b4。实施例5单克隆抗体的鉴定1.单克隆抗体的亚型鉴定按照鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自proteintech公司)说明书进行2株单克隆抗体ig亚型的鉴定，鉴定结果见表2。单克隆抗体2e11和3b4重链分别为igg1、igg2a，轻链均为kappa链。表2单克隆抗体的亚型鉴定结果亚型2e113b4igg11.7270.159igg2a0.2821.839igg2b0.3430.121igg30.1090.088iga0.1410.157igm0.1120.083kappa0.7120.968lambda0.0970.0972.单克隆抗体的可变区序列测定提取杂交瘤细胞2e11和3b4的mrna，反转录为cdna后使用可变区通用引物进行高保真pcr扩增，将pcr产物进行dna序列测定。dna序列测定结果：编码单克隆抗体2e11的基因，其重链可变区编码基因dna序列如序列表中seqidno：1，其轻链可变区编码基因dna序列如序列表中seqidno：2，编码单克隆抗体3b4的基因，其重链可变区编码基因dna序列如序列表中seqidno：3所示，其轻链可变区编码基因dna序列如序列表中seqidno：4所示。实施例6elisa检测试剂盒的制备采用a型单克隆抗体2e11，a型口蹄疫病毒样颗粒蛋白，hrp标记的a型口蹄疫单克隆抗体3b4建立固相竞争elisa方法，利用方阵滴定法确定包被单抗2e11的最佳工作浓度为0.5μg/孔(每孔50μl)，a型病毒样颗粒蛋白工作浓度为10μg/孔(每孔50μl)，酶标单抗的最佳工作浓度为1:5000稀释(每孔50μl，含有0.6μg/孔)，血清最佳稀释倍数为1：5。包被：将口蹄疫a型包被抗体2e11以0.5μg/孔，轻轻振荡混匀，2～8℃过夜包被；封闭：弃去板内液体，洗涤3～5遍，拍干，每孔加入100μl1.5％bsa，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后37℃温育2h；加入抗原：弃去板内液体，洗涤3～5遍，拍干，每孔加入50μl稀释至工作浓度的口蹄疫a型蛋白，用封板膜封板后37℃温育1h；加样：弃去板内液体，洗涤3～5遍，拍干，分别加入50μl阴性对照(重复2孔)，50μl阳性对照(重复2孔)，以及50μl1：5倍稀释的待检血清，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后37℃温育1h；加酶标抗体：不需要洗涤，每孔加入50μl口蹄疫a型酶标抗体3b4(1:5000)，浓度为12μg/ml，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后37℃温育1h；显色：弃去板内液体，洗涤3～5遍，拍干，每孔加入50μl显色a液和显色b液，37℃避光温育10～15min；终止：按照加入底物的顺序，每孔加入50μl终止液(1m浓硫酸)终止反应，用酶标仪在450nm波长下读取od值。结果判定：阻断率pi(％)＝1-(待检血清od/阴性对照平均od)×100阻断率≥50％时为阳性，阻断率<50％时为阴性试验成立条件阴性对照od值须≥1，阳性对照阻断率>50％实施例7elisa试剂盒的鉴定1.特异性鉴定三个连续批号的试剂盒对10份口蹄疫阴性血清进行检测，评价其特异性。结果见表3。表3elisa试剂盒检测阴性血清结果另分别对口蹄疫o型抗体阳性血清，猪瘟病毒抗体阳性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性血清，猪塞尼卡谷病毒抗体阳性血清和大肠杆菌抗体阳性血清进行检测，同时设立a型口蹄疫阳性血清为对照。结果见表4。表4elisa试剂盒特异性实验结果批次o型csfvprrsvsvve.coli阳性批次13.76％3.78％10.42％10.75％9.51％91.29％批次24.22％1.27％8.89％12.15％9.54％90.73％批次36.05％3.80％7.50％11.76％8.50％89.43％三个连续批号的试剂盒检测10份阴性血清全部阴性，证明其特异性符合要求；三个连续批号的试剂盒检测其他猪病病毒，除阳性猪血清对照为阳性外，其余均为阴性；表明本发明elisa试剂盒与其他抗病毒均无交叉反应，试剂盒特异性较好。2.灵敏度鉴定将a型口蹄疫阳性血清进行2倍梯度稀释，用本发明制备的固相阻断试剂盒进行测定，确定该试剂盒对阳性对照血清的灵敏度，结果见表5。表5对滴度稀释的a型阳性对照血清的灵敏度试验稀释倍数阻断率(％)结果判定1:895.78％+1:1693.50％+1:3283.91％+1:6472.81％+1:12859.14％+1:25637.23％-阳性对照91.66％+结果显示，试剂盒检测滴度稀释的阳性血清，检测效价达到1:128。表明，本发明的固相阻断elisa试剂盒灵敏度较高。3.重复性试验使用3个不同批次的酶标板，在一块板上进行批内重复试验，在不同板上进行批间重复试验，测定od450值，计算变异系数。变异系数＜10％，说明试剂盒重复性和稳定性好。结果表明，3各不同批次的酶标板，批内和批间检测结果一致，变异系数均＜5％，说明试剂盒重复性很好。变异系数(c·v)计算公式：c·v(％)＝(od450标准差/od450平均值)×100％实施例7试剂盒的应用对比试验将a型口蹄疫阳性血清170份，用本发明制备的固相阻断试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表6。表6试剂盒对a型口蹄疫检测比对实验结果结果显示，固相阻断试剂盒三个批次试剂盒均能100％检出阳性；而液相阻断试剂盒三个批次检测结果有差异，最低91.8％，最高96.5％，批间有差异。上述结果表明，本发明固相阻断试剂盒针对a型口蹄疫抗体具有较好检测能力，也能较好解决目前液相阻断elisa试剂盒批次间差异较大，稳定性差的问题。以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。sequencelisting<110>洛阳普泰生物技术有限公司<120>抗a型口蹄疫病毒单克隆抗体及其应用<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>345<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1caggtccaacttcagcagcctggggctgaactggtgaaatctgggacttcagtgaaaatg60tcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagttactggattcactgggtgaagcagagg120ccgggacaaggccttgagtggattggagatatttttcctactagtgatagtattaactac180aatgagaagttcaagaccaaggccacactgactgtagacacatcctccagtacagcctac240atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgccattcttcta300tccgtgggctactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca345<210>2<211>340<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2gacattgtgatgacacagtttccatcctccctgaccgtgacagcaggagagaaggtcact60atgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaacttcttgacc120tggtaccagcagaagtcagggcagccccctaaactgttgatctactgggcatccactagg180gaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatccagaacagatttcactctcacc240atcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattataattat300ccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaac340<210>3<211>354<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3caggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctg60tcctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagagg120cctggacaaggccttgagtggattggaaatatttatcctgatagtggtagttttaattac180gatgagaaattcaagagcaaggccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctac240atgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtacaagagtccac300tataggcacgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca354<210>4<211>306<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagagggtcacc60atgacctgcagtgccagctcaggtgtaagttacatgtactggtatcagcagaagccagga120tcctcccccagactcctgatttatgccacatccaacttggcttctggagtccctgttcgc180ttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaa240gatgctgccacttattactgccagcagtggacttattacccgttcacgttcggagggggg300accgag306当前第1页12