一种提高白细胞介素1受体相关激酶蛋白产量的蛋白改造方法与流程

本发明属于基因技术和微生物技术领域，具体涉及一种提高白细胞介素1受体相关激酶蛋白产量的蛋白改造方法。

背景技术：

白细胞介素1受体相关激酶(interleukin-1receptor-associatedkinase,irak1)是一类细胞内激酶，在toll样受体(tlr)及白介素-1受体(il1-r)介导的信号通路中发挥着重要作用，能够调节促炎因子的生成，对炎症反应起着正向或负向调节作用。

近年来的研究发现，炎症与许多疾病的发生密切相关，在神经系统疾病中，脑血管病、神经退行性病变中的ad、癫痫等疾病的病理生理过程都涉及到炎症反应。目前这些疾病的治疗仍然面临着严峻的考验，很多患者的病情得不到有效的控制，对患者家庭，社会造成沉重负担。irak1作为炎症反应的调节者，在神经系统疾病中的作用逐渐被人们认识、重视，为神经系统疾病的发病机制的研究及临床治疗提供了新的思路及方向。另外，irak1具有激酶活性，作为细胞溶质激酶，核激酶及接头蛋白，参与调控tlr/il1-r两个受体家族的信号级联反应，调节tnfα，i型ifn及ap-1等炎症因子的表达，irak1的这些功能是其参与了内毒素的耐受，并成为自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎、系统红斑狼疮等的关键调节因子。对irak1的深入研究将为炎性和感染性疾病的研究提供理论依据，为疾病的治疗提供新的契机。肝细胞癌是全球第五常见的癌症，也是第二致命的癌症，有研究发现irak1是肝癌潜在的治疗靶点。鉴于irak1的在疾病治疗过程中重要的作用，能有效正确的表达该蛋白就显得非常重要。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种提高白细胞介素1受体相关激酶蛋白产量的蛋白改造方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种提高白细胞介素1受体相关激酶蛋白表达的改造方法，包括如下步骤：

(1)白细胞介素1受体相关激酶蛋白的原始基因序列如seqidno.1所示；

(2)以小鼠肝脏组织或肺组织提取的rna经反转录制备的cdna为模板，用两对引物f1/r1和fm/rm，通过overlappcr扩增技术将原始基因序列中“第115位～第120位”的碱基序列“caggag”进行同义突变，得到新的基因序列如seqidno.2所示；

(3)将步骤(2)所得序列如seqidno.2所示的基因片段构建到pet32a表达载体中，再转化至大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白诱导表达，纯化获得白细胞介素1受体相关激酶蛋白。

上述方案中，所述两对引物f1/r1和fm/rm的序列如下：

f1:5′-cgcggatcccaccgtcgggccaagaagag-3′bamhi

r1:5′-ccgctcgaggctctggaattcatcactttc-3′xhoi

fm:5′-ttccccacaagaaaactcctacatgtctac-3′

rm:5′-ggagttttcttgtggggaaggggagccatg-3′

上述方案中，所述同义突变是指将碱基序列“caggag”突变成碱基序列“caagaa”。

上述方案中，所述载体构建的具体操作过程：以小鼠肝脏组织或肺组织提取的rna经反转录制备的cdna为模板，分别用引物f1和rm，fm和r1进行pcr扩增得到pcr产物p1，p2；再以pcr产物p1、p2为模板，用引物f1和r1进行pcr扩增得到pcr产物p3；用bamhi和xhoi分别对pcr产物p3、pet32a质粒进行双酶切，采用t4dna连接酶进行连接并转化至大肠杆菌dh5α筛选得到正确的重组质粒pet32a-irak1，然后将其转化至大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白诱导表达，对表达的蛋白进行纯化，其蛋白浓度达到了5mg/ml。

本发明的有益效果：本发明通过分析白细胞介素1受体相关激酶蛋白的基因序列，将其中类似核糖体结合位点序列aggag进行同义突变，有效避免了次级翻译起始位点的存在导致表达蛋白被截短、蛋白异常表达的问题；经本发明所述方法改造后的基因序列在诱导表达白细胞介素1受体相关激酶蛋白时获得了分子量大小符合预期的目的蛋白，实现了白细胞介素1受体相关激酶蛋白的正常表达，白细胞介素1受体相关激酶蛋白只有在正确表达形成正确构象后才会发挥其作用；且大大提高了白细胞介素1受体相关激酶蛋白的表达产量，其蛋白浓度能达到5mg/ml。

附图说明

图1为原始基因构建的载体pet32a-irak1蛋白表达异常的电泳图，其中1：marker，2-4：pet32a-irak1转化大肠杆菌bl21(de3)，5：pet32a转化大肠杆菌bl21(de3)。

图2为改造后的载体pet32a-irak1蛋白表达正常的电泳图，其中1：marker，2-4：pet32a-irak1转化大肠杆菌bl21(de3)，5：pet32a转化大肠杆菌bl21(de3)。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。鼠源irak1蛋白原始基因序列

实施例1

在原核表达系统中表达鼠源irak1蛋白的时候发现蛋白表达的分子量与所选区域蛋白分子量存在明显差异，核对测序结果与原始序列完全匹配而且能够正常翻译。分析原因发现：基因序列里存在次级翻译起始位点，即一个类似核糖体结合位点(aaggagg)的序列加上适当的间隔序列(一般为5～13核甘酸)，位于aug(met)密码子上游，该次级翻译起始位点的存在可能会导致表达的蛋白被截短，影响蛋白的正常表达。

本发明设计两对引物(f1/r1、fm/rm)通过overlappcr技术将基因序列中存在类似核糖体结合位点进行同义突变，目的基因序列中存在的类似核糖体结合位点处的碱基(caggag)编码的是glnglu，将其进行同义突变后碱基序列为(caagaa)，然后将目的基因片段构建到pet32a表达载体中，转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行诱导表达蛋白，纯化获得目的蛋白。

具体的操作步骤如下：(1)白细胞介素1受体相关激酶蛋白的原始基因序列如seqidno.1所示；

(2)以小鼠肝脏组织或肺组织提取的rna经反转录制备的cdna为模板，用两对引物f1/r1和fm/rm，通过overlappcr扩增技术将原始基因序列中“第115位～第120位”的碱基序列“caggag”进行同义突变，得到新的基因序列如seqidno.2所示；

所述两对引物f1/r1和fm/rm的序列如下：

f1:5′-3′cgcggatcccaccgtcgggccaagaagagbamhi

r1:5′-3′ccgctcgaggctctggaattcatcactttcxhoi

fm:5′-3′ttccccacaagaaaactcctacatgtctac

rm:5′-3′ggagttttcttgtggggaaggggagccatg

所述pcr扩增反应的体系为

所述pcr扩增反应条件为：

(3)将步骤(2)所得序列如seqidno.2所示的基因片段构建到pet32a表达载体中，再转化至大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白诱导表达，纯化获得目的蛋白，具体构建-转化-诱导表达的操作过程为:(1)以小鼠肝脏组织或肺组织提取的rna经反转录制备的cdna为模板，分别用引物f1和rm，fm和r1进行pcr扩增得到pcr产物p1，p2；(2)以步骤(1)中得到的pcr产物p1、p2为模板，用引物f1和r1进行pcr扩增得到pcr产物p3；(3)用bamhi和xhoi分别对pcr产物p3、pet32a质粒进行双酶切并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测及回收；(4)用t4dna连接酶将回收得到的产物在16℃条件下连接过夜；(5)将连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布在具有氨苄(amp)抗性lb固体平板上，倒置于37℃培养箱培养12～14h；(6)对固体lb平板上的单菌落进行菌落pcr(使用pet32a载体通用引物)，通过琼脂糖凝胶检测筛选出阳性克隆子，将其送测序公司测序，待测序结果出来后与原始序列比对确认测序结果是否正确以及要突变的位点是否突变成功；(7)将测序正确且突变成功的重组质粒pet32a-irak1转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞并涂布在具有氨苄(amp)抗性lb固体平板上，倒置于37℃培养箱培养12～14h；(8)挑取步骤(7)中平板上的单菌落接种至3ml含有氨苄(amp)抗性lb液体培养基中，置于37℃恒温摇床中，200rpm培养至od600约0.6时加入iptg使其终浓度为0.5mm/l，于37℃恒温摇床中，200rpm继续培养诱导3h；(9)以5000rpm离心3min，收集菌体，加入100μl1xsds-pageloadingbuffer沸水浴10min，sds-page电泳检测目的蛋白是否表达；(10)对表达的目的蛋白进行纯化。

原始核苷酸序列和突变后的核苷酸序列对比结果如下所示：

*前后两端是载体序列中的酶切位点，黑体加粗部分为突变位点。

将其翻译成氨基酸结果如下(如seqidno.3所示)：

*前后两端是载体序列中的酶切位点翻译的氨基酸，除去前后4个氨基酸，其余完全匹配。

对本发明构建所得载体进行测序并与原始序列进行比对(比对结果如上)，测序比对分析结果显示：除突变位点外，其余基因序列与原始序列完全匹配，说明了对irak1基因序列中存在的类似核糖体结合位点成功进行了同义突变。同时，将原始irak1基因序列构建到pet32a表达载体中，再转化至大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白诱导表达；以及将经本申请所述成功进行同义突变的基因序列构建到pet32a表达载体中，再转化至大肠杆菌bl21(de3)进行蛋白诱导表达，分别对诱导表达的蛋白进行电泳分析，结果如图1和图2所示，从图1可知：原始irak1基因序列所表达的蛋白分子量在20～21kda左右，分子量与irak1蛋白的分子量存在明显差异；从图2可知：经同义突变的irak1基因序列所表达的蛋白分子量在40kda左右，符合预期蛋白分子量大小(40kda)。这表明，经本发明所述方法改造后，实现了白细胞介素1受体相关激酶蛋白的正常表达，白细胞介素1受体相关激酶蛋白只有在正确表达形成正确构象后才会发挥其作用，大大提高了白细胞介素1受体相关激酶蛋白的表达产量，其蛋白浓度能达到5mg/ml。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>武汉赛维尔生物科技有限公司

<120>一种提高白细胞介素1受体相关激酶蛋白产量的蛋白改造方法

<160>3

<210>1

<211>627bp

<212>dna

<213>鼠源irak1蛋白原始基因序列

<400>1

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<210>2

<211>639bp

<212>dna

<213>鼠源irak1蛋白改造后基因序列

<400>2

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gggcttcaggcagggcctccctgggagctagaggttgccggccatggctccccttcccca120

caagaaaactcctacatgtctaccactggcagtgcccagagtggggatgaaccatggcag180

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<213>鼠源irak1蛋白

<400>3

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