一种细胞微载体分离装置的制作方法

本发明属于生物细胞工程技术领域，具体涉及一种细胞微载体分离装置。

背景技术：

微载体培养是目前细胞培养领域中常见的一种技术，是采用细小的微粒作为载体(大小100μm左右)与细胞(大小10μm左右)悬液充分混合后，细胞可附着于载体表面进行培养增殖的一种细胞培养技术。微载体培养兼有通常单层培养和悬浮培养的优势，具有细胞增殖速度快，适应范围广等优点。在疫苗生产、病毒生产或部分免疫细胞培养领域中，微载体培养可广泛应用于一些贴壁细胞的培养，不需要进行培养驯化，保持细胞的贴壁特性，且可充分利用细胞培养液，快速扩增。

通常，贴壁细胞的微载体培养中，目的细胞的收获是其中最终的关键工序。一般操作是在完成培养后加入分解酶将细胞从微载体上分离开，再通过离心或过滤装置进行收集。

细胞治疗作为一种精准医疗手段，目前大多采用慢病毒载体将外源基因转染至免疫细胞，病毒生产工艺使用贴壁细胞，远远达不到常规一些生产企业所使用的大批量千升级生产级别的悬浮细胞生物反应器，多采用多层细胞工厂或微载体生产工艺。由于收获产物不同，无法采用抗体生产工艺中的过滤澄清方法，单纯收集细胞时可采用离心法，但当细胞与微载体共同培养后需要分离时，简单的离心法往往无法达到理想的分离效果，且增加工艺流程复杂程度，此外，与微载体共培养的细胞密度较高，可以达到1×10⁷/ml以上，采用过滤方法下穿过滤膜时则容易发生堵塞分离滤膜。

因此，本领域仍然需要一种更有效的适用于分离各种体积规模的细胞微载体混合液的细胞微载体分离装置。

技术实现要素：

本发明提供一种过滤器，包括容器框架结构和一个或多个挡件支撑件；其中，所述容器框架结构包括形成容器上部开口的结构、与所述形成容器上部开口的结构连接的形成于容器四周的用于固定滤膜的滤膜固定件和与所述滤膜固定件连接的底部容器；其中，所述挡件支撑件设置在所述容器框架结构的外部，固定在所述滤膜固定件上，且所述挡件支撑件与挡件支撑件和滤膜固定件的连接点处的法线成10°～30°的夹角。

在一个或多个实施方案中，所述滤膜固定件具有镂空结构，用于固定滤膜；所述挡件支撑件具有镂空结构，用于固定滤膜。

在一个或多个实施方案中，所述过滤器还包括第一滤膜和第二滤膜，所述第一滤膜固定在所述滤膜固定件上，所述第二滤膜固定在所述挡件支撑件上；所述第一滤膜和第二滤膜的网眼尺寸介于细胞培养所用的微载体的尺寸与细胞尺寸之间，用于截留所述微载体。

在一个或多个实施方案中，所述过滤器还包括端盖，所述端盖固定在所述形成容器上部开口的结构上，并将所述上部开口密封，所述端盖上设有两个通孔。

本发明还提供一种细胞微载体分离装置，包括：

罐体；

置于罐体内部的过滤器；和

其搅拌装置设置在过滤器内部的搅拌系统；

其中，所述过滤器包括容器框架结构，所述容器框架结构包括形成容器上部开口的结构、与所述形成容器上部开口的结构连接的形成于容器四周的用于固定滤膜的滤膜固定件和与所述滤膜固定件连接的底部容器。

在一个或多个实施方案中，所述过滤器为本发明任一实施方案所述的过滤器。

在一个或多个实施方案中，所述分离装置还包括进液口和废液出口，所述进液口设置于罐体的顶部或上部侧壁，所述废液出口设置于罐体的下部侧壁或底部。

在一个或多个实施方案中，所述细胞微载体分离装置还包括用于密封所述罐体、以在罐体内部形成密闭空间的端盖，所述端盖上具有连通罐体外部和过滤器内部的两个通孔，其中，一个通孔用于安装所述搅拌系统，另一个通孔用于排出细胞。

在一个或多个实施方案中，所述搅拌系统包括电机、搅拌轴和搅拌桨，所述搅拌轴连接所述搅拌桨与所述电机的转轴，并伸入过滤器内部。

本发明还提供一种细胞微载体分离装置，包括：

罐体；

可密封连接于罐体的端盖；

置于罐体内部的过滤器；和

其搅拌装置设置在过滤器内部的搅拌系统；

其中，所述罐体的顶部或上部侧壁上设有进液口，罐体的下部侧壁或底部上设有废液出口；

所述端盖上设有连通罐体外部和过滤器内部的第一通孔和第二通孔，第一通孔用于安装所述搅拌系统，第二通孔用于排出细胞；

所述过滤器包括容器框架结构和一个或多个挡件支撑件；其中，所述容器框架结构包括形成容器上部开口的结构、与所述形成容器上部开口的结构连接的形成于容器四周的用于固定滤膜的滤膜固定件和与所述滤膜固定件连接的底部容器；其中，所述挡件支撑件设置在所述容器框架结构的外部，固定在所述滤膜固定件上，且所述挡件支撑件与挡件支撑件和滤膜固定件的连接点处的法线成10°～30°的夹角；所述滤膜固定件具有镂空结构，用于固定滤膜；所述挡件支撑件具有镂空结构，用于固定滤膜；且，所述过滤器还包括第一滤膜和第二滤膜，所述第一滤膜固定在所述滤膜固定件上，所述第二滤膜固定在所述挡件支撑件上；所述第一滤膜和第二滤膜的网眼尺寸介于细胞培养所用的微载体的尺寸与细胞尺寸之间，用于截留所述微载体。

附图说明

图1为本发明的细胞微载体分离装置的结构示意图。

图2为本发明的细胞微载体分离装置的过滤器、搅拌轴和搅拌桨的横截面示意图。

附图标记说明如下：

1.罐体；2.过滤器；3.挡件支撑件；4.滤膜固定件；5.电机；6.搅拌轴；7.搅拌桨；8.进液口；9.细胞液出口；10.废液出口；11.端盖；111.第一通孔；112.第二通孔。

具体实施方式

为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本发明的细胞微载体分离装置，可适用于各种体积规模的细胞液处理，尤其适用于中小型1～50l左右的体积规模的细胞液处理。

本发明的细胞微载体分离装置包括罐体、过滤器和搅拌系统。其中，过滤器安装在罐体内部，过滤器上可固定滤膜；搅拌系统用于在液体中形成其涡流中心位于过滤器内部的旋涡流场。开启搅拌系统后，过滤器外的微载体和细胞均向过滤器内的涡流中心流动，流至过滤器上的滤膜处，尺寸小于滤膜孔径的细胞能够正常通过，尺寸大于滤膜孔径的微载体则被截留，由此分离出微载体细胞混合液中的微载体和细胞。

本发明中，罐体的形状不受特别限制，例如可以是圆筒形、长方体形等。

细胞微载体分离装置还可包括可密封连接于罐体的端盖。在某些实施方案中，过滤器安装在罐体内部，密封固定在端盖上。端盖上具有连通罐体外部和过滤器内部的第一通孔。搅拌系统包括电机、搅拌轴和搅拌桨。电机安装在端盖上。与电机的转轴相连的搅拌轴通过端盖上的第一通孔伸入过滤器内部。搅拌轴上固定有搅拌桨。搅拌系统的搅拌装置包括搅拌轴和搅拌桨，设置在过滤器内部。在某些实施方案中，本发明的过滤器呈圆筒形。

本发明的细胞微载体分离装置还可包括进出液口。进出液口包括进液口、细胞液出口和废液出口。进液口位于罐体上部的侧壁或端盖上，用于连通罐体外部和罐体内的过滤器外部的空间。端盖上具有连通罐体外部和过滤器内部的第二通孔，细胞液出口形成于第二通孔处。废液出口位于罐体下部的侧壁或底部，用于连通罐体外部和罐体内部的过滤器外部部分。

本发明的过滤器包括容器框架结构和任选的第一滤膜。容器框架结构包括形成容器上部开口的结构、与该形成容器上部开口的结构连接的形成于容器四周用于固定滤膜的滤膜固定件和与所述滤膜固定件连接的底部容器。容器框架结构形成一端为敞口、另一端为封口的结构。本文中，敞口端称作过滤器的顶部，封口端称作过滤器的底部。滤膜固定件优选为圆筒形。滤膜固定件具有镂空结构。第一滤膜可拆卸地固定在滤膜固定件上，因此，第一滤膜可以耗材的形式另外提供。第一滤膜的网眼尺寸(孔径)被设定为允许细胞穿过同时截留微载体，通常不大于100μm，例如可以为不大于70μm、50～70μm等。通常，滤膜固定件上镂空部位的面积占其总面积的大部分，以充分发挥第一滤膜的过滤功能。在某些实施方案中，滤膜固定件上镂空部位的面积占其总面积的50％以上，如60％以上、70％以上、80％以上、90％以上等。第一滤膜在滤膜固定件上的固定方式不受特别限制，例如，滤膜固定件上可具有与第一滤膜的形状大小相匹配的插槽，第一滤膜可插入该插槽而固定在滤膜固定件上。在某些实施方案中，滤膜固定件具有双层的框体结构，第一滤膜可放置夹取在两层框体之间。与滤膜固定件连接的底部容器优选具有向外突出的形状，如向外突出的浅圆锥形、向外突出的浅圆碟形、向外突出的球面形、向外突出的截头圆锥形等，以减小液体流动阻力和对细胞的剪切力。通常，过滤器通过形成容器上部开口的结构密封固定在端盖上。可采用本领域常规方法将过滤器密封固定在端盖上。在某些实施方式中，形成容器上部开口的结构的边缘具有突出部，端盖上具有与该突出部配合的嵌合部，过滤器通过将突出部嵌入到端盖上的嵌合部而固定在端盖上；优选的，端盖上的嵌合部中可装有橡胶密封圈，保证过滤器与端盖之间的密封连接。

在某些实施方案中，本发明的过滤器还包括一个或多个挡件支撑件和任选的第二滤膜。挡件支撑件具有平板状外形和镂空结构。第二滤膜可拆卸地固定在挡件支撑件上，因此，第二滤膜可以耗材的形式另外提供。挡件支撑件和第二滤膜组成挡件。第二滤膜的网眼尺寸(孔径)被设定为允许细胞穿过滤膜同时截留微载体，通常不大于100μm，例如可以为不大于70μm、50～70μm等。通常，挡件支撑件上镂空部位的面积占总表面积的大部分，以充分发挥第二滤膜的过滤功能。在某些实施方案中，挡件支撑件上镂空部位的面积占总表面积的50％以上，如60％以上、70％以上、80％以上、90％以上等。第二滤膜在挡件支撑件上的固定方式不受特别限制，例如，挡件支撑件上可具有与第二滤膜的形状大小相匹配的插槽，第二滤膜可插入该插槽而固定在挡件支撑件上。在某些实施方案中，挡件支撑件具有长条状的双层框体结构，第一滤膜可夹取放置在两层框体之间。挡件支撑件设置在容器框架结构的外部，固定在滤膜固定件上；优选的，挡件支撑件设置为平行于滤膜固定件的轴向。本发明的过滤器可包括多个挡件支撑件。在过滤器包括多个挡件支撑件的实施方案中，多个挡件支撑件优选等间距地或对称环绕固定在滤膜固定件上。

在某些实施方案中，图2所示，挡件支撑件被设置为朝向搅拌轴的转动方向倾斜，使得挡件能够在旋涡流场中截留微载体的同时，保证微载体具有一定的流动性，避免堵死第二滤膜。优选的，挡件支撑件与其和滤膜固定件的连接点a处的法线成10～30°的夹角(如图2中的∠α所示)。

对挡件支撑件的长度(过滤器的轴向)无特别限制，可与滤膜固定件的高度相同或小于滤膜固定件的高度，例如可以是滤膜固定件高度的1/5到4/5，或者为滤膜固定件高度的1/2到4/5。对挡件支撑件的宽度也无特别限制，例如可以是过滤器内径的1/10到1/2，或者为过滤器内径的1/5到1/3。应理解，挡件支撑件的宽度方向上的延伸应不触碰到罐体的内壁。当挡件支撑件的长度短于滤膜固定件高度时，对挡件支撑件在过滤器轴向上的摆放位置并无特殊限制，例如，可摆在滤膜固定件外部的正中位置(即挡件支撑件上端离滤膜固定件上端的距离与挡件支撑件下端离滤膜固定件下端的距离相同)，或者使挡件支撑件的下端与滤膜固定件的下端(即滤膜固定件与底部容器的连接处)齐平。

本发明可采用本领域的常规连接机构，如轴封，连接电机的转轴与搅拌轴。通常，搅拌轴可转动地密封通过第一通孔，例如，搅拌轴与第一通孔的连接处可设置有橡胶密封圈等。在某些实施方案中，本发明的细胞微载体分离装置还包括控制器，控制器电连接电机，用于控制电机的运行。第一通孔优选位于固定在端盖上的过滤器的轴线上。优选的，第一通孔、搅拌轴轴线和固定在端盖上的过滤器的轴线位于同一直线上。搅拌轴上的搅拌桨在电机的带动下转动，进而搅动过滤器内的液体。搅拌桨可以是已知的能够产生旋涡流场的搅拌桨，通常具有2-5片桨叶，例如可以是叶片数目为3片的推进式螺旋桨。搅拌桨在转动过程中能在液体中形成旋涡流场，使得过滤器外的微载体和细胞向涡流中心流动。桨叶通常具有大直径、高扭力、低剪切力的特点。优选的，桨叶边缘圆润光滑，使得搅拌桨在转动过程中不会对细胞造成损害。

本发明中，进液口为待分离的微载体细胞混合液和酶液的进液口，细胞液出口为目的细胞的出液口，废液出口为罐体中废液的出液口。进液口优选设置在端盖上或罐体侧壁上靠近端盖的位置。废液出口优选设置在罐体底部或罐体侧壁上靠近罐体底部的位置。进液口、细胞液出口和/或废液出口上各自任选地密封固定有进液管路、细胞液管路或废液管路，各管路可与相应的液体储存装置相连。在某些实施方案中，细胞液出口上的细胞液管路伸入到过滤器的内部，以便于目的细胞的取出。进液管路、细胞液管路和/或废液管路上可设置有用于控制相应管路畅通和关闭的开关。进液管路、细胞液管路和/或废液管路上还可设置有用于驱动管路内液体流动的驱动机构，例如可以是各种形式的泵。

本发明的细胞微载体分离装置还包括控制器，控制器电连接一个或多个开关和/或驱动机构，用来控制开关和/或驱动机构的运行。

本发明中，罐体、滤膜固定件、挡件支撑件的材质通常为易于清洗消毒的不锈钢。第一滤膜和第二滤膜的材质可以为聚合物、金属、陶瓷、复合材料等。

使用本发明的细胞微载体分离装置对微载体细胞混合液中的细胞和微载体进行分离时，先向罐体内加入待分离的微载体细胞混合液；微载体细胞混合液中的细胞可是附着在微载体上的，也可是已从微载体上脱离；若加入的微载体细胞混合液中的细胞是附着在微载体上的，则需要加入分离酶液，并充分混合；在过滤器的滤膜固定件和任选的挡件支撑件内放置相应的第一滤膜和任选的第二滤膜，将过滤器固定在端盖上；盖上端盖，开启搅拌系统，电机通过搅拌轴带动搅拌桨转动，在液体中形成旋涡流场。此时，过滤器外的微载体和细胞均向涡流中心流动，当流至过滤器的滤膜固定件上的第一滤膜时，由于粒径不同，细胞能够正常通过滤膜进入过滤器内部，而微载体被阻隔在过滤器外部。

在过滤器包括挡件支撑件的实施方案中，设置在滤膜固定件上的挡件支撑件上的第二滤膜优先将液体涡流中的微载体截取下来，防止液体涡流过快通过滤膜固定件上的第一滤膜而引起堵塞，保证更多的细胞顺利通过滤膜固定件上的第一滤膜进入过滤器内。在某些实施方案中，挡件支撑件被设置为顺着搅拌轴的转动方向倾斜一定的角度，使得挡件不仅能够截取涡流场中的微载体，还能保证所截取的微载体具有一定的流动性，避免微载体直接堵死在第二滤膜后，造成细胞的损失。

当搅拌系统转动一段时间后，保持稳定的搅动速度，目的细胞大多处于涡流场的中心，此时打开细胞液出口的管路开关及驱动管路内液体流动的驱动机构，可完成涡流场中心目的细胞液的收集。收集过程中可酌情从进液口加入一些缓冲液，清洗过滤器上的滤膜，增加细胞回收率。分离完成后，搅拌系统停止转动，打开端盖将过滤器底部少量的细胞液也一起收集出来。打开废液出口可回收被截留在过滤器外部的微载体。

本发明的细胞微载体分离装置，适用于各种体积规模的微载体和细胞的分离，具有以下有益效果：

1.本发明的细胞微载体分离装置利用旋涡流场和滤膜分离微载体和细胞，操作时间快，分流效率高；

2.为避免离心过程中，微载体直接在涡流场中堵塞过滤器的滤膜，本发明的过滤器上设置了挡件，挡件设置为顺着搅动电机转动方向切斜一定的角度，不仅能够在涡流场中截取微载体，还能保证微载体有一定的流动性，避免直接堵死挡件的滤膜后，引起细胞的损失；

3.本发明的过滤器上的第一滤膜和第二滤膜分别可拆卸地固定在滤膜固定件和挡件支撑件上，为了清洗或更换，可方便地从滤膜固定件和挡件支撑件上移除，且能够根据实际需求选择使用不同的滤膜，提高了生产效率，降低了设备配置和维护成本；

4.使用本发明的细胞微载体分离装置分离完成后，可直接由细胞液出口取出目的细胞液，操作便捷，简化了实验操作。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，任何与所记载内容相似或均等的装置及构造皆可应用于本发明中。

实施例1

本实施例结合附图描述本发明的一种微载体分离装置。

如图1所示，分离装置包含罐体1、过滤器2、搅拌系统及进出液口。罐体1可容纳待分离的微载体细胞混合液。罐体1具有端盖11，可对罐体1进行密封。罐体1的材质为不锈钢。

过滤器2包含挡件支撑件3和容器框架结构，任选地还包含第一滤膜和第二滤膜。容器框架结构包括形成容器上部开口的结构、与该形成容器上部开口的结构连接的形成于容器四周用于固定滤膜的滤膜固定件4和与固定件连接的底部容器。挡件支撑件3的材质为不锈钢。挡件支撑件3具有长条形双层框体结构，中间可放置第二滤膜。挡件支撑件3和第二滤膜组成挡件。滤膜固定件4的材质为不锈钢。滤膜固定件4为圆筒形。与滤膜固定件4连接的底部容器呈向下突出的浅圆锥形。滤膜固定件4具有双层框体结构，中间可放置第一滤膜。第一滤膜固定在滤膜固定件4上。第一滤膜和第二滤膜的材质为聚合物。第一滤膜和第二滤膜的网眼尺寸被设定为允许细胞穿过滤膜且截留微载体，通常不大于100μm。挡件支撑件3固定在滤膜固定件4上，挡件支撑件3的长度方向与滤膜固定件4的轴向平行。过滤器2位于罐体1内部，过滤器2的开口端密封固定在端盖11上。

搅拌系统包含电机5、搅拌轴6和搅拌桨7。电机5固定在端盖11上。搅拌轴6与电机5的转轴相连。搅拌轴6通过端盖11上的第一通孔111，进入过滤器2内部。搅拌桨7固定在搅拌轴6上。搅拌桨7在电机5的带动下转动，进而搅动过滤器2内的液体，在液体中形成旋涡流场。

如图2所示，挡件支撑件3被设置为朝向搅拌轴6的转动方向倾斜。挡件支撑件3与挡件支撑件3和滤膜固定件4的连接点a处的法线成10-30°的夹角(即图2中的∠α)。六块挡件支撑件3等间距地环绕固定在滤膜固定件4上。

进出液口包括进液口8、细胞液出口9和废液出口10。进液口8为待分离的微载体细胞混合液和酶液的进液口。细胞液出口9为目的细胞的出液口。废液出口10为罐体1中废液的出液口。进液口8位于端盖11上，用于连通罐体1外部和罐体1内部的过滤器2外部部分。细胞液出口9通过端盖11上的第二通孔112，用于连通罐体1外部和过滤器2内部。废液出口10位于罐体1的侧壁下方，用于连通罐体1外部和罐体1内部的过滤器2外部部分。进液口8、细胞液出口9和废液出口10上分别密封固定有进液管路、细胞液管路和废液管路，各管路上具有用于控制管路畅通和关闭的开关。

实施例2

本实施例结合附图描述使用实施例1的微载体分离装置进行微载体和细胞分离的操作过程。

分离装置工作时，首先由进液口8加入待分离的微载体细胞混合液和分离酶液，并充分混合。在过滤器2的滤膜固定件4和挡件支撑件3内都放置过滤膜(孔径为50～70μm)，将过滤器2固定在端盖11上。盖上端盖11，开启搅拌系统，电机5通过搅拌轴6带动搅拌桨7快速转动，在液体中形成旋涡流场。此时，过滤器2外的微载体和细胞均向涡流中心流动，当流至过滤器2的滤膜固定件4上的第一滤膜时，由于粒径不同，细胞能够正常通过、进入过滤器2内部，而微载体被阻隔在外部。

同时，设置在滤膜固定件4上的挡件支撑件3上的第二滤膜优先将液体涡流中的微载体截取下来，防止液体涡流过快通过滤膜固定件4上的第一滤膜而引起堵塞，保证更多的细胞顺利通过第一滤膜进入过滤器2内。

挡件支撑件3设置为朝向搅拌轴6的转动方向倾斜，使得挡件支撑件3不仅能够截取涡流场中的微载体，还能保证所截取的微载体具有一定的流动性，避免微载体直接堵死挡件支撑件3上的第二滤膜后，引起细胞的损失。

当搅拌系统转动一段时间后，保持稳定的搅动速度，目的细胞大多处于涡流场的中心，此时打开细胞液出口9的管路开关及驱动管路内液体流动的驱动机构，可完成涡流场中心目的细胞液的收集。在某些实施方案中，收集过程中可酌情从进液口8加入一些的缓冲液，清洗过滤器2上的滤膜，增加细胞回收率。分离完成后，搅拌系统停止转动，打开端盖11将过滤器2底部少量的细胞液也一起收集出来。打开废液出口10可回收被截留在过滤器2外部的微载体。