大黄鱼IL-4/13A基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大黄鱼il-4/13a基因在毕赤酵母中表达产物的制备方法及其应用。

背景技术：

白细胞介素4（interleukin-4，il-4）和il-13属于i型细胞因子，分子量一般为12-20kd(luzina,i.g.,a.d.keegan,n.m.heller,g.a.rook,t.shea-donohue,ands.p.atamas.2012.regulationofinflammationbyinterleukin-4:areviewof"alternatives".journalofleukocytebiology92:753-764.)，是一种多功能的细胞因子，几乎对所有从造血干细胞（hematopoieticstemcell）分化而来的免疫细胞都有作用，主要功能体现在以下三个方面：通过上调表达b细胞表面的mhcii型分子、cd23和il-4受体（il-4r），诱导b细胞增殖和特异性抗体产生，介导体液免疫应答(nelms,k.,a.d.keegan,j.zamorano,j.j.ryan,andw.e.paul.1999.theil-4receptor:signalingmechanismsandbiologicfunctions.annualreviewofimmunology17:701-738.)；诱导前体细胞分化成th2效应细胞，促进th2细胞发育而抑制th1细胞活性(luzina,i.g.,a.d.keegan,n.m.heller,g.a.rook,t.shea-donohue,ands.p.atamas.2012.regulationofinflammationbyinterleukin-4:areviewof"alternatives".journalofleukocytebiology92:753-764.)；通过抑制巨噬细胞中炎症因子tnf-α、il-1β、il-6和il-8等的表达和增加tgf-β、vegf和egf等生长因子的产生，诱导巨噬细胞向m2型活化(zhu,l.y.,p.p.pan,w.fang,j.z.shao,andl.x.xiang.2012.essentialroleofil-4andil-4ralphainteractioninadaptiveimmunityofzebrafish:insightintotheoriginofth2-likeregulatorymechanisminancientvertebrates.journalofimmunology188:5571-5584.)。

鱼类il-4/13与哺乳动物il-4和il-13氨基酸序列的同源性非常低，近年来通常采用共线性分析的方法寻找。首个鱼类il-4报道于2007年，位于绿河豚（tetraodonnigroviridis）基因组上临近rad50的位置，与哺乳动物il-4相比氨基酸序列同源性只有11-16%(li,j.h.,j.z.shao,l.x.xiang,andy.wen.2007.cloning,characterizationandexpressionanalysisofpufferfishinterleukin-4cdna:thefirstevidenceofth2-typecytokineinfish.molecularimmunology44:2078-2086)；后来又在斑马鱼（daniorerio）基因组上临近kif3a位置，发现了两个il-4基因，定位在不同的染色体上，分别命名为il-4/13a和il-4/13b，并且斑马鱼il-4（il-4/13a）已经证实能够与il-4rα特异性结合、促进b细胞增殖及增加特异性igm产生，这些结果表明鱼类可能存在与哺乳动物类似的th2免疫反应。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种高效表达大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母工程菌。

本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母表达产物及其制备方法。

本发明的目的之三在于提供大黄鱼il-4/13a重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体产生方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效表达大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌的分类命名为：毕赤酵母（pichiapastoris）smd1168/ppiczαa-il-4/13a，于2019年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2019598，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

一种上述高效表达大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼il-4/13a重组蛋白，所述大黄鱼il-4/13a重组蛋白的分子量为25kda(糖基化后)。该重组蛋白作为免疫佐剂与细菌亚单位疫苗配合使用，显著增加大黄鱼特异性抗体的产生。

一种高效表达大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母工程菌的表达产物大黄鱼il-4/13a重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）克隆大黄鱼il-4/13a基因全长cdna序列，采用pcr技术扩增出编码第21位至第148位氨基酸的大黄鱼il-4/13a成熟肽基因片段，其核苷酸序列如seqidno.3所示，表达的成熟肽的氨基酸序列如seqidno.4所示；

（2）将步骤（1）得到的大黄鱼il-4/13a成熟肽基因片段克隆到毕赤酵母真核表达载体ppiczαa上，经博来霉素筛选及测序鉴定后，得到含大黄鱼il-4/13a基因片段的重组表达载体ppiczαa-il-4/13a；

（3）将重组表达载体ppiczαa-il-4/13a线性化后，经电击法转化至毕赤酵母（pichiapastoris）smd1168感受态细胞，经酵母重组子的pcr分析后，获得含有大黄鱼il-4/13a基因片段的阳性重组子毕赤酵母工程菌pichiapastorissmd1168/ppiczαa-il-4/13a；

（4）将上述阳性重组子的毕赤酵母工程菌接到酵母培养基1中，30°c,220rpm震荡培养；待od600至2.0，将上述菌液倒入离心管，4°c，6000g离心7min，去上清，用酵母培养基2重悬，30°c,220rpm震荡培养，每隔24h添加1%甲醇诱导4天，使其达到最高表达量，同时使用sds-page检测其表达情况；

（5）将步骤（4）诱导表达好的菌液于4°c，12000g离心10min，取上清，加入终浓度0.2mnacl和终浓度10mm咪唑，4°c静置过夜；将静置过夜的上清12000g，4°c离心10min，再使用0.45μm的滤膜过滤；将过滤后的上清液缓慢滴入含有1mlni²⁺介质的层析柱，流速为3~4ml/min；用酵母杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10ml；再用酵母蛋白洗脱液洗脱，直至洗净目的蛋白；sds-page分析收集的各组分。

上述步骤（4）中所述酵母培养基1配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)、1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基（ynb）；酵母培养基2配方为：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)、1%甲醇、1.34%ynb和0.00004%生物素。

上述步骤（5）中所述酵母杂蛋白洗涤液的配方为：20mmnah2po4、500mmnacl、20mm咪唑，ph=7.4；所述酵母蛋白洗脱液的配方为：20mmnah2po4、500mmnacl、750mm咪唑，ph=7.4。

一种大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母表达产物大黄鱼il-4/13a重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体产生方面的应用。

大黄鱼il-4/13a重组蛋白作为免疫佐剂应用于促进大黄鱼特异性抗体的产生，包括以下步骤：根据genbank中溶藻弧菌dld基因的序列信息（agk62253.1），从大黄鱼的溶藻弧菌中扩增获得溶藻弧菌dld基因，并使其在大肠杆菌中重组表达dld蛋白，以获得的重组dld蛋白作为抗原用于特异性抗体产量分析实验。

具体实验过程如下：试验组选择10ug的重组il-4/13a蛋白与100μg重组dld蛋白混合腹腔注射大黄鱼（体重：50g-70g），1周后以相同剂量加强免疫一次；对照组的大黄鱼采用同样方式注射10μgbsa蛋白和重组dld蛋白；免疫28、35和42天后收集大黄鱼外周血血清，采用elisa方法分析大黄鱼血清中anti-dldigm的产量。

使用10ug的重组il-4/13a蛋白腹腔注射大黄鱼（体重：50g-70g），48h后收集大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血，用梯度密度离心法分离白细胞，使用大黄鱼igm的单克隆抗体结合流式细胞仪分析淋巴细胞中b细胞的比例，对照组的大黄鱼采用同样方式注射10μgbsa蛋白。

本发明的优点在于：本发明成功构建了高效表达大黄鱼il-4/13a基因的毕赤酵母工程菌，该工程菌表达的大黄鱼il-4/13a基因重组蛋白作为免疫佐剂在促进大黄鱼特异性抗体中具有重要作用，能显著促进大黄鱼血清中anti-dldigm的产量的增加。

附图说明

图1为大黄鱼il-4/13a基因全长cdna序列的扩增以及菌落pcr电泳图。在图1.a中，m为标准蛋白分子量marker；1泳道为从文库种扩增得到的大黄鱼il-4/13a基因，约447个核苷酸。

图2为纯化的大黄鱼il-4/13a重组蛋白的sds-page鉴定。在图2中m为预染蛋白分子量marker；1泳道为含有ppiczαa载体的毕赤酵母工程菌培养液上清；2泳道为毕赤酵母工程菌smd1168/ppiczαa-il-4/13a培养液上清；3泳道为纯化的il-4/13a重组蛋白。

图3为大黄鱼血清中anti-dldigm产量分析图。大黄鱼il-4/13a重组蛋白与弧菌亚单位疫苗共同免疫的大黄鱼后，不同时间点大黄鱼血清中anti-dldigm的产量分析图，4w：第4周，5w：第5周，6w：第6周；^*p<0.01，^**p<0.05；以相同浓度的牛血清白蛋白刺激为对照组。

图4为大黄鱼il-4/13a重组蛋白腹腔注射48h小时后，大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血白细胞中igm⁺b细胞增殖的分析图。a、b和c分别为头肾、脾脏和外周血中igm⁺b细胞增增殖的流式示意图；d为大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血白细胞中igm⁺b细胞增殖的点状图；hkls:头肾白细胞，sls:脾脏白细胞，pbls:外周血白细胞；^*p<0.01,^**p<0.05。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1大黄鱼il-4/13a基因cdna的获得

通过对大黄鱼脾脏转录组文库分析，发现了大黄鱼il-4/13acdna序列，经pcr扩增,获得了大黄鱼il-4/13a的全长cdna,该序列全长447个核苷酸（如seqidno.1所示），编码一个由148个氨基酸组成的蛋白质（如seqidno.2所示）。

所述大黄鱼il-4/13a基因cdna及其推断的氨基酸序列如下：

其中，灰色高亮表示起始密码子和终止密码子。单下划线表示信号肽。保守的半胱氨酸用方框表示。n-糖基化位点用双下划线表示。

实施例2含大黄鱼il-4/13a成熟肽序列重组表达载体ppiczα-il-4/13a的构建

（1）大黄鱼il-4/13a成熟肽片段的pcr扩增：合成正向引物il-4/13a-f:gagaaaagagaggctgaagctgaaaatcctcttcatcaacag和反向引物il-4/13a-r:ctcttctgagatgagtttttgttccatgtctttggaagcccc；以大黄鱼il-4/13a基因cdna为模板扩增出编码第21位至第148位氨基酸的大黄鱼il-4/13a成熟肽基因片段，其核苷酸序列如seqidno.3所示，表达的成熟肽的氨基酸序列如seqidno.4所示。使用全式金公司的transstart®fastpfuflydnapolymerase按照说明书进行pcr扩增，pcr体系为：

5×transstart^®fastpfuflydnapolymerase缓冲液10μl

dntp4μl

正向引物(10μm)1μl

反向引物(10μm)1μl

cdna模板(100ng/μl)1μl

transstart^®fastpfuflydnapolymerase1μl

双蒸水补至50μl。

pcr程序如下：

1.94℃2分钟

2.94℃30秒

3.58℃30秒

4.72℃30秒，返回第2步，35个循环

5.72℃10分钟

6.4℃保存。

pcr扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件：电压120伏，1电泳时间15分钟。使用凝胶成像仪观察，可见一条与预期相符的核苷酸条带，然后用omega公司胶回收试剂盒回收pcr扩增产物。

（2）酶切和连接反应：酵母真核表达载体ppiczαa经ecori和xhoi酶切3h后进行同源重组连接，使用全式金公司peasy-uniseamlesscloningandassemblykit，连接体系如下：

2xpeasy-uniseamlesscloningandassembly5μl

pcr扩增产物4μl

酶切后的载体ppiczαa1μl

反应条件：50℃反应15分钟。

（4）连接产物转化novogen公司大肠杆菌e.colitop10感受态细胞，经菌落pcr筛选阳性克隆，扩大培养后，使用omega公司质粒小量提取试剂盒提取质粒，并测序验证，从而获得了含大黄鱼il-4/13a成熟肽基因片段的重组表达载体ppiczαa-il-4/13a。

实施例3毕赤酵母pichiapastorissmd1168/ppiczαa-il-4/13a工程菌的构建

将含有大黄鱼il-4/13a成熟肽基因片段的重组表达载体ppiczαa-il-4/13a经线性化后，用电击转化法转化至毕赤酵母smd1168感受态细胞中，将转化后的菌液分别涂布于含250µg/ml、500µg/ml和1mg/ml博来霉素的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基上，30℃静置培养2-4天，长出单菌落，经菌落pcr后得到含有大黄鱼il-4/13a成熟肽基因的毕赤酵母pichiapastorissmd1168/ppiczαa-il-4/13a工程菌。

培养基配方：

酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基：2%蛋白胨、1%酵母抽提物、2%葡萄糖和1.5%琼脂粉。

实施例4大黄鱼il-4/13a基因在毕赤酵母中表达及其表达产物纯化

1.大黄鱼il-4/13a重组蛋白的诱导表达及sds-page分析

将实施例3获得的毕赤酵母pichiapastorissmd1168/ppiczαa-il-4/13a工程菌接到酵母培养基1中，30°c,220rpm震荡培养。待od600至2.0，将上述菌液倒入离心管，4°c，6000g离心7min，去上清，用酵母培养基2重悬，30°c震荡培养。每隔24h添加1%甲醇诱导4天，使其达到最高表达量，同时使用sds-page检测其表达情况。

酵母培养基1配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)、1%甘油和1.34%无氨基酵母氮源培养基（ynb）。

酵母培养基2配方：1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph6.0)、1%甲醇、1.34%ynb和0.00004%生物素。

2.亲和层析法纯化大黄鱼il-4/13a重组蛋白

将上述诱导表达好的菌液于4°c，12000g离心10min，取上清，加入nacl(终浓度0.2m)和咪唑(终浓度10mm)，4°c静置过夜。将静置过夜的上清12000g，4°c离心10min，再使用0.45μm的滤膜过滤。将过滤后的上清液缓慢滴入含有1mlni²⁺介质的层析柱，流速为3~4ml/min；用酵母杂蛋白洗涤液洗涤5次，每次10ml。再用酵母蛋白洗脱液洗脱，直至洗净目的蛋白。sds-page分析收集的各组分。

所述酵母杂蛋白洗涤液的配方为：20mmnah2po4、500mmnacl、20mm咪唑，ph=7.4。

所述酵母蛋白洗脱液的配方为：20mmnah2po4、500mmnacl、750mm咪唑，ph=7.4。

3.大黄鱼il-4/13a重组蛋白的透析

纯化后大黄鱼il-4/13a重组蛋白用缓冲液透析三次，4℃,12000r/min离心30min去除沉淀，取少量进行sds-page电泳分析，结果显示得到了纯度较高的大黄鱼il-4/13a重组蛋白，保存于-70℃备用；

透析缓冲液配方：0.27g/lnah2po4、1.42g/lna2hpo4、8g/lnacl、0.2g/lkcl,ph7.3,10%甘油。

实施例5大黄鱼il-4/13a重组蛋白对特异性抗体产生的作用

本实验室现有保藏分离于患病大黄鱼的溶藻弧菌，根据genbank中溶藻弧菌dld基因的序列信息（agk62253.1），从大黄鱼的溶藻弧菌中扩增获得溶藻弧菌dld基因，使其在大肠杆菌中重组表达，以重组dld蛋白作为抗原用于特异性抗体产量分析实验。

具体实验过程如下：试验组选择10ug的重组il-4/13a蛋白与100μg重组dld蛋白混合腹腔注射大黄鱼（体重：50g-70g），1周后以相同剂量加强免疫一次；对照组的大黄鱼采用同样方式注射10μgbsa蛋白和重组dld蛋白；免疫28、35和42天后收集大黄鱼外周血血清，采用elisa方法分析大黄鱼血清中anti-dldigm的产量。图3结果表明，免疫10ug大黄鱼il-4/13a重组蛋白dld第5周后，大黄鱼血清中anti-dldigm的的效价提高了2.6倍。

使用10ug的重组il-4/13a蛋白腹腔注射大黄鱼（体重：50g-70g），48h后收集大黄鱼头肾、脾脏组织和外周血，用梯度密度离心法分离白细胞，使用大黄鱼igm的单克隆抗体结合流式细胞仪分析淋巴细胞中b细胞的比例，对照组的大黄鱼采用同样方式注射10μgbsa蛋白。图4结果表明，大黄鱼il-4/13a重组蛋白可以显著促进大黄鱼igm⁺b细胞的增殖，最高可促进50%的比例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>大黄鱼il-4/13a基因毕赤酵母表达产物制备方法及其应用

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