基因的应用及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及基因的应用及其检测试剂盒。

背景技术：

我国是世界第一养蜂大国，蜂产品产量居世界前列。同时，蜜蜂也是维持生态环境持续发展不可或缺的物种，是植物、特别是新兴的设施作物的主要授粉昆虫。蜜蜂养殖业的关键是种蜂王，其优劣直接影响养蜂经济效益。产卵性状是蜂王直接展现出的唯一经济性状，同时也是蜂群产生经济效益的重要基础性状。卵巢是蜂王发挥产卵功能的主要器官，卵巢大小是评价蜂王质量的重要标准，卵巢大的蜂王产卵量更多。但是卵巢大小难以测量，采用传统的育种方法，难以实现对卵巢大小的选育。因此，筛选和鉴定蜜蜂卵巢大小相关的候选基因，开展分子育种，对培育大卵巢、高繁殖力的蜜蜂品种(系)有重要意义。

蜜蜂的工蜂和蜂王具有完全相同的基因组，却拥有大小差异显著的卵巢：工蜂只有2个卵巢管，而蜂王拥有几百根卵巢管。处女蜂王在未交配之前，卵巢没有激活，卵巢相对较小；而在交配之后，卵巢被激活，卵巢因开始发挥排卵等功能，而变得更大。工蜂、处女蜂王和产卵蜂王是蜜蜂中典型的、拥有大小差异显著的卵巢的代表。因此，研究工蜂、处女蜂王和产卵蜂王的卵巢差异表达基因，是鉴定蜜蜂卵巢大小候选基因的有效途径。

目前，蜜蜂育种者主要采用传统的配套系制种的方法，培育高繁殖性状的蜂王。但是，由于蜜蜂卵巢大小难以测量，因此，没有开展针对卵巢大小的育种工作。在过去的几十年中，伴随着分子生物学和数量遗传学方法的进步，逐渐出现了许多新的技术帮助研究人员对难以测定性状进行分子育种工作，例如标记辅助选择技术等。采用分子标记开展标记辅助选择育种，在猪、牛、羊等畜种早在上世纪末就已经开始，近几年来，猪、牛等畜种的全基因组选择都已开展的如火如荼。而蜜蜂育种在分子育种方面却还未开发出成熟的候选基因。候选基因法已经被证明是一个非常有利的用来鉴定显著影响性状表型的基因的手段，候选基因在性状相关的生理过程中发挥重要功能作用，并最终影响性状表型。因此，鉴定候选基因是开展分子育种工作的基础。

转录组学是从rna水平研究基因表达的情况，能够从整体水平研究基因表达量以及基因结构，揭示特定生物学过程中的分子机理。转录组测序技术能够获得特定细胞或组织，在某一功能状态下所能转录出来的所有mrna，目前已广泛应用于基础研究、临床诊断、药物研发和分子育种等领域，是鉴定候选基因的有效手段。目前，研究人员主要采用测序、芯片等方法筛选蜜蜂蜂王卵巢的dna或mrna的表达情况。但未见蜜蜂卵巢大小相关的候选基因鉴定的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了基因的应用及其检测试剂盒。本发明采用转录组测序测序技术，筛选了在工蜂、处女蜂王和产卵蜂王的卵巢组织差异表达的的基因，并通过与卵巢大小相关的qtl比对的方法，进一步鉴定影响卵巢大小的基因，获得了与蜜蜂卵巢大小密切相关的基因14个。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了基因作为标志物在鉴定蜜蜂卵巢大小中的应用，所述基因的genebank序号包括410320、726963中的一种或两种。

本发明提供的应用中，所述基因的genebank序号还包括410254、726180、552303、100577456、724154、725821、413668、725462、552651、100577041、552577、410343中的一种或多种。

本发明采用转录组测序技术，筛选了在工蜂、处女蜂王和产卵蜂王的卵巢组织差异表达的基因，并通过与卵巢大小相关的qtl比对的方法，进一步鉴定影响卵巢大小的基因，获得了与蜜蜂卵巢大小密切相关的基因14个。经长期研究发现，以包含genebank序号为410320、726963中的一种或两种的基因作为标志物选择出的卵巢较大的蜜蜂品种，以此培育的蜜蜂品种(系)产卵量较多、繁殖力较高。

在一些具体实施方案中，所述基因的表达量上调，蜜蜂的卵巢较大；所述基因的genebank序号选自726180、552303、724154、725821、413668、725462、552651、726963、100577041、410343。

在一些具体实施方案中，所述基因的表达量上调，蜜蜂的卵巢较小；所述基因的genebank序号选自410320、410254、100577456、552577。

本发明提供的基因作为标志物在鉴定蜜蜂卵巢大小中的应用，所述蜜蜂包括工蜂、处女蜂王和产卵蜂王。

本发明还提供一种用于鉴定蜜蜂蜂王卵巢大小的标志物的筛选方法，包括如下步骤：

步骤1：分别获得产卵蜂王、处女蜂王和工蜂的卵巢组织，分别提取rna；

步骤2：测序获得所述rna的序列信息；

步骤3：通过序列比对、分析，获得所述工蜂、处女蜂王和产卵蜂王的卵巢组织差异表达的mrna，差异表达标准为p<0.05；并获得所述差异表达的基因的物理位置；

步骤4：所述差异表达的基因的物理位置落在卵巢大小qtl区间内的基因即为标志物；

所述标志物的genebank序号选自410320、726963、410254、726180、552303、100577456、724154、725821、413668、725462、552651、100577041、552577、410343。

本发明还提供一种蜜蜂蜂王卵巢大小的鉴定方法，包括：

获得各待测样本中标志物的表达量；

比较各待测样本中标志物的表达量，所述待测样本中标志物表达量较低的，则卵巢较大，所述标志物的genebank序号选自410320、410254、100577456、552577；

所述待测样本中标志物表达量较高的，则卵巢较大，所述标志物的genebank序号选自726180、552303、724154、725821、413668、725462、552651、726963、100577041、410343。

本发明提供的鉴定方法可以比较任意两个待测样本，如第一待测样本和第二待测样本卵巢的大小。如果第一待测样本的标志物的表达量低于第二待测样本，则第一待测样本的卵巢大于第二待测样本；所述标志物选自410320、410254、100577456、552577中的一种或两种以上。

如果第一待测样本的标志物的表达量高于第二待测样本，则第一待测样本的卵巢大于第二待测样本；所述标志物选自726180、552303、724154、725821、413668、725462、552651、726963、100577041、410343中的一种或两种以上。

本发明提供的鉴定方法还可以从多个待测样本中筛选出卵巢较大的蜜蜂品种。首先获得各待测样本中标志物的表达量；所述待测样本中标志物表达量较低的，其卵巢较大，所述标志物选自410320、410254、100577456、552577中的一种或两种以上；所述待测样本中标志物表达量较高的，其卵巢较大，所述标志物选自726180、552303、724154、725821、413668、725462、552651、726963、100577041、410343中的一种或两种以上。

本发明提供的鉴定方法还可以从多个待测样本中筛选出卵巢最大的蜜蜂品种。首先获得各待测样本中标志物的表达量；所述待测样本中标志物表达量最低的，其卵巢最大，所述标志物选自410320、410254、100577456、552577中的一种或两种以上；所述待测样本中标志物表达量最高的，其卵巢较最，所述标志物选自726180、552303、724154、725821、413668、725462、552651、726963、100577041、410343中的一种或两种以上。

本发明还提供一种鉴定蜜蜂卵巢大小的试剂盒，包括扩增genebank序号为410320、726963、410254、726180、552303、100577456、724154、725821、413668、725462、552651、100577041、552577、410343中的一种或两种以上的基因的引物对。

本发明提供的试剂盒，还包括taq酶、pcrbuffer和无酶水。

本发明提供的试剂盒还包括内参引物对。

本发明提供了基因作为标志物在鉴定蜜蜂卵巢大小中的应用，所述基因的genebank序号包括410320、726963中的一种或两种。本发明利用高通量测序技术，筛选除了在工蜂、处女蜂王和产卵蜂王的卵巢组织差异表达的基因，并通过与卵巢大小相关的qtl比对的方法，进一步鉴定影响卵巢大小的关键基因。本发明提供的蜜蜂卵巢大小的关键基因具有精准定位的特点；对开展蜜蜂繁殖性状分子育种、选育大卵巢、高繁殖力的蜜蜂品种(系)具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示蜜蜂卵巢大小相关的5个候选基因的定量pcr与测序结果的关联性分析图，每个基因做3个样品重复，其中，r>0.8为显著相关。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。如无特征说明以上实施例中，各组分均为市售商品。

实施例1

1.样品采集

实验蜜蜂工蜂、处女蜂王和产卵蜂王由中国农业科学院蜜蜂研究所实验蜂场提供。(1)工蜂卵巢组织：选择蜂场中蜂群健康、品种特征一致的3群蜂，每群采集工蜂100只，在显微镜下采集工蜂卵巢组织。由于工蜂的卵巢很小，因此每群蜂的卵巢混合作为一个样品，共3个样品重复；(2)处女蜂王和产卵蜂王卵巢组织：选择2组(每组3个重复)健康、体况基本一致的意大利处女蜂王。其中，第1组在处女王性成熟时期采集卵巢组织(处女王组)；另外1组进行人工授精处理，在蜂王正常产卵后采集卵巢组织。所有组织样品采集后迅速放入液氮中冻存，用于rna的提取。

2.组织样品总rna提取

(1)将预先准备好的1.5ml离心管中加入1mltrizol(invitrogen)，写上样品编号。

(2)将需要提取rna的样品从液氮中取出，在研钵中加入液氮进行研磨。始终保持样品存在于液氮中，研磨得越细越好。

(3)将研磨成粉状的样品倒入预先准备的trizol中，剧烈摇晃至样品完全溶解于trizol中，至透明。

(4)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(5)取上清，加入0.2ml氯仿，剧烈混匀15s，放置冰上10min。

(6)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(7)取上清，加入0.5ml异丙醇，轻晃至析出沉淀。

(8)放置冰上10min。

(9)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(10)去上清，用枪头洗掉剩余的液体。

(11)加入1ml的75％乙醇，洗涤沉淀。

(12)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(13)重复一次洗涤过程。

(14)4℃，12000rpm,离心10-15min。

(15)倒出液体，洗掉剩余液体，室温晾干，约3min。

(16)加入约60-100μldepc水溶解rna，放置冰上溶解15min。

(17)保存于-80℃冰箱。

3.mrna测序文库构建：

(1)使用epicentreribo-zerotmrrnaremovelkit(epicentre,usa)去除核糖体rna(rrna)；

(2)使用ultratmdirectionalrnalibraryprepkitfor(neb,usa)构建测序文库。

(3)测序平台illuminahiseq4000，产生序列150bppaired-endreads。

(4)参考基因组amel_4.5。

4.mrna的鉴定：

rawreads经过质控以后得到cleanreads。使用tophatv2.0.9软件，将cleanreads与蜜蜂基因组进行mapping，根据已知mrna在基因组中的位置，鉴定获得蜜蜂卵巢组织mrna。

5.差异mrna的筛选：

使用deseqpackage(1.8.3)程序包对测序数据进行分析，筛选工蜂、处女蜂王和产卵蜂王之间差异表达的mrna。使用benjamini&hochber计算差异检验p值。差异表达筛选标准是校正p<0.05，fc>1。

6.差异表达mrna结果：

本研究选取工蜂、处女蜂王和正常产卵蜂王作为研究对象(n＝3/组)，利用转录组测序和生物信息学的方法筛选获得在任意两组之间均差异表达的mrna，即在工蜂vs处女蜂王、工蜂vs产卵蜂王、产卵蜂王vs处女蜂王三个比较组合中均差异表达的mrna，共1009个。

实施例2差异表达mrna与卵巢大小相关的qtl区间进行比对

已知蜜蜂卵巢大小相关的qtl位于蜜蜂基因组11号染色体8.9mb到12.2mb之间。将实施例2获得的1009个差异基因与该qtl区间进行比对，落在该区间内的差异基因即为蜜蜂卵巢大小相关的候选基因，共14个(表1)

表1蜜蜂卵巢大小相关的候选基因

实施例3定量pcr验证

为验证测序结果的可靠性，选择实施例2中14个候选基因中的5个进行了定量pcr的验证，每个基因做3个样品重复。试验样品的分组与测序部分一致，持家基因actin作为内参基因。表达量的计算采用法。通过spss软件进行相关性分析发现，定量检测结果与测序检测结果的表达趋势基本一致，两者相关性在80％以上，说明测序结果和定量结果中基因的表达趋势一致，说明测序结果真实可靠(如图1所示)。部分基因的测序结果与定量结果比较见表2。

表2基因的定量pcr验证

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。