一种可提高植物耐盐性的基因及其应用的制作方法

本发明属于植物培育技术领域，具体涉及一种可提高植物耐盐性的基因myb30以及该基因在培育耐盐作物品种中的应用。

背景技术：

农业生产是社会经济和物质生产的基础和重要组成部分，其中植物生产在农业生产中又占有重要的基础地位。由于植物固着生长的特性，使其在遭受多变环境带来的不利影响时无法通过移动的方式来规避不利的自然条件。盐胁迫显著影响种子萌发、作物生长和粮食收获。全球范围内目前有超过9亿公顷的土地(约占世界陆地总面积的6％)受到盐浓度过高的影响，且存在进一步恶化的趋势。盐胁迫通常是由钠离子和氯离子浓度过高引起的，诱导的胁迫信号可分为三类，其中离子胁迫应激信号与渗透胁迫应激信号帮助重建胁迫条件下细胞的稳态；氧化胁迫应激信号可控制和修复细胞损伤，并协调细胞代谢以适应压力环境。阐明上述应激途径的分子机制对于理解并提高植物的耐盐性极为关键。

中国是土壤盐碱化大国，盐碱地面积在全球位居第三，主要分布在西北、华北、东北以及包括滨海地区(黄河三角洲等)在内的17个省区，这对我国农业生产造成了巨大的负面影响。盐碱地的治理不可能一蹴而就，需从不同层面加以解决。植物的耐盐机制不是单一的信号通路，具有复杂性和交错性，且不同植物响应盐胁迫的具体机制也各不相同。寻找有效的耐盐基因对耐盐作物种质资源的开发具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现状，本发明提供一种可提高植物耐盐性的基因myb30以及该基因在培育耐盐作物品种中的应用，以实现提高植物耐盐性的目的。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种可提高植物耐盐性的基因myb30，该基因的核苷酸序列如下：

atggtgaggcctccttgttgtgacaaaggaggagtgaagaaagggccatggactcctgaagaagatatcattttagtcacttacatccaagaacatggtcctggtaattggagagctgttcctaccaatactgggctgcttagatgcagcaagagttgtagacttagatggacaaactatttaaggccaggaatcaaaagaggcaatttcacagaacatgaagaaaagatgattgttcatctccaagccctcttaggaaatagatgggctgcaattgcgtcatatcttccacaaaggacagacaatgacattaagaactattggaacactcatttgaagaagaaactcaacaaagtcaatcaagattctcatcaagaacttgaccgttcctcgctctcatcttcaccatcgtcttcttctgctaattccaactcaaacatctcaagaggccaatgggaaaggcgacttcaaaccgatatccacttggcgaaaaaggctctctctgaggctttatctcctgccgttgcaccaatcattacatctacagtgacaacaacgtcttcctctgctgaatcaagacgctctacttcctcagctagcggtttcttaggacgcaagaaacatctacaacttatgcctcaagcaccgaaaatatcgcgaaattgctcaaagggtgggtgaaaaactcgccgaagactcaaaactccgcggatcaaatcgcttctacagaggtaaaagaagtgatcaagagtgatgatgggaaggagtgtgcaggggcatttcagtcattttctgagtttgatcactcatatcaacaggctggtgtttcacctgatcatgagaccaaaccagacataactggatgctgcagtaaccaaagtcaatggtctttgtttgagaagtggttgtttgaggattctggtggacagattggtgatattctattggatgaaaacactaatttcttctga(seq.idno.1)。

该基因可编码出具有如下氨基酸序列的蛋白质：

mvrppccdkggvkkgpwtpeediilvtyiqehgpgnwravptntgllrcskscrlrwtnylrpgikrgnfteheekmivhlqallgnrwaaiasylpqrtdndiknywnthlkkklnkvnqdshqeldrsslssspssssansnsnisrgkwerrlqtdihlakkalsealspavapiitstvtttsssaesrrstasasgflrtqetsttyassteniakllkgwvknspktqnsadqiastevkeviksddgkecagafqsfsefdhsyqqagvspdhetkpditgccsnqsqwslfekwlfedsggqigdilldentnff(seq.idno.2)。

另外，本发明还通过t-dna插入技术和转基因技术，构建了myb30功能缺失突变体植株和myb30过量表达转基因植株，验证myb30对于提高植物耐盐性的正调节作用。

本发明的有益效果是：

提供了一种新的提高植物耐盐性的基因myb30，在模式植物拟南芥中对其参与调节植物耐盐性的分子机制进行了分析，这为通过构建转基因植株来提高植物耐盐能力提供了分子生物学原理上的支撑，使农作物改良成为解决土壤盐碱化对农业影响的重要手段之一。

附图说明

图1为野生型拟南芥col-0和pro35s：myb30/myb30-2回补植株(com)的总rnart-pcr分析；

图2为野生型拟南芥col-0和pro35s：myb30^k283r/myb30-2点突回补植株(mcom)的总rnart-pcr分析；

图3为col-0、myb30-2、com#1及com#2材料的盐敏感表型分析结果；

图4为col-0、myb30-2、com#1及com#2材料盐处理过程中子叶变绿情况；

图5为col-0、myb30-2、com#1及com#2材料的盐处理过程中子叶变绿时间轴统计；

图6为col-0、myb30-2、mcom#1及mcom#2材料的盐敏感表型分析结果；

图7为col-0、myb30-2、mcom#1及mcom#2材料的盐敏感表型分析过程中子叶变绿情况；

图8为qrt-pcr检测相关植物材料中活性氧响应基因defl的表达；

图9为h2dcfda染色测定相关植物材料体内ros积累结果；

图10为col-0、myb30-2、com#1及mcom#2材料的甲基紫精(mv)敏感表型分析结果；

图11为col-0、myb30-2、com#1及mcom#2材料的mv敏感表型分析过程中子叶变绿情况；

具体实施方式

本技术所用到的实验材料包括拟南芥野生型(col-0)以及基于t-dna插入技术和转基因技术构建的myb30相关缺失突变体及转基因材料：pro35s：：flag-myb30/myb30-2(com株系)和pro35s：：flag-myb30^k283r/myb30-2(mcom株系)，所有材料均提取rna并通过rt-pcr检测myb30基因的表达情况。

实施例一：突变体及转基因植株鉴定

一、材料rna提取(probegene，离心柱型)

材料rna的提取包括如下步骤：

(1)取大约100mg新鲜材料置于2ml离心管中，在液氮中充分研磨，动作迅速，然后加入1mltrizol；

(2)研磨样品充分振荡后在15～30℃(室温)下放置5min，将混合液中的复合物全部分离；

(3)4℃，12000rpm离心10min，吸取上清至无菌的1.5ml离心管中；

(4)每管加入200μl氯仿，剧烈振荡30s，室温放置5～10min

(5)再次4℃，12000rpm离心15min，样品会分为上中下三层，将上层水相转移到新的离心管中；注意不到触及中间相；

(6)加入250μl无水乙醇，轻摇混匀，全部转入吸附柱中，室温12000rpm离心1min；

(7)弃废液，加入600μl漂洗液washbuffer，室温13000rpm离心1min，弃掉废液，重复一次；

(8)空管13000rpm离心1min，彻底除去漂洗液；

(9)更换收集管，在吸附膜中间加入50μldepc-ddh2o，室温静置2min，12000rpm离心2min；可重复离心一次；

(10)使用超微量分光光度计检测rna浓度，以检测提取效果。

二、edna的合成

(1)根据测定的rna浓度，计算每个样品所需的rna模版。需保证有5μg总rna进行反转录实验。利用m-mlvreversetranscriptase试剂盒(invitrigen，美国)进行实验。

(2)首先用ddh2o补齐至16.15μl后，每管加入1μloligo-dt(500ng/μl)。

(3)70℃水浴反应5min。

(4)冰上静置5min。

(5)在冰上快速将下述配方预混液加入反应体系(总体积25μl)。所有操作均在冰上进行。反应体系如表1所示：

表1

(6)瞬时离心，将样品放入37℃水浴锅中水浴60min，使片段充分延伸。

(7)70℃水浴反应15min以终止反应。按需要可加ddh20稀释至指定浓度。-20℃冰箱保存反转录成功的cdna样品。

(8)反转录完成后，需检测cdna质量，及qpcr引物的效率。按照如表2所示的pcr体系进行(总体积10μl)：

表2

pcr程序设定：95℃4min，95℃30s，54℃30s，72℃10min，30×循环，72℃10min，16℃forever。

三、rt-pcr

(1)按照表3中的配方配置pcr体系(总体积25μl)：

表3

pcr程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，，30×循环，72℃10min，16℃forever。

(2)得到pcr产物后，进行电泳检测，后通过灰度定量表达量。电泳结果如图1和图2所示。从中可以看出，myb30基因在拟南芥野生型(col-0)以及转基因材料(com#1、com#2、mcom#1、mcom#2)中均得以表达，而在myb30-2突变体中没有表达。

实施例二：植物耐盐性分析

一、myb30在植物响应盐胁迫过程中发挥重要调节作用

拟南芥播种时首先将所需材料适量置于1.5ml离心管中，种子消毒液(75％乙醇，0.1％trionx-100)消毒20min。接下来的操作均在无菌超净台中进行：用无菌双蒸水清洗3次；在1/2ms培养基上播种相应种子；并用封口膜封好后取出。将平板倒置与4℃冰箱中2天，后在24℃培养至所需大小的幼苗。土培材料则在1/2ms培养基中培养10天后移至营养土(土∶蛭石＝2∶1)中培养。生长条件为：24℃，光照强度为0.3mmol.m^-2.s^-1，16hr光照/8hr黑暗。

植物耐盐性分析：将拟南芥野生型(col-0)、myb30-2突变体及对应的回补转基因材料(com#1、com#2)播种于正常1/2ms培养基以及加入125mmnacl的1/2ms培养基中，置于正常培养条件下培养7天，期间统计萌发率和子叶变绿情况并拍摄照片，结果如图3与图4所示。从图中可以看出，四种材料在正常培养基中均能正常萌发，萌发率类似且幼苗也能正常变绿；但是在含盐的培养基中，myb30功能缺失突变体(myb30-2)萌发率明显低于野生型及回补植株，并且myb30-2突变体萌发后不能正常变绿，子叶变绿率也远低于另外几组(图3与图4)；由此可知，myb30基因对植物耐盐性能具有关键调节作用。

另外，对四种材料的子叶变绿情况进行了持续统计，结果如图5所示。可以看出，在正常培养基中培养时四种材料的子叶变绿时间保持一致；而在含盐培养基中培养时，myb30功能缺失突变体(myb30-2)在相同的时间内，子叶变绿率显著低于野生型及回补植株材料；该结果进一步说明myb30基因对植物的耐盐性起到决定性作用。

二、myb30点突回补株系的盐表型分析

前人研究已经报道sumoe3连接酶sizi能介导myb30的sumo化修饰，从而调控其功能。因此，本发明也通过构建pro35s：：flag-myb30^k283r/myb30-2(mcom)株系来进一步分析myb30介导到植物耐盐性调节是否也依赖myb30的sumo化修饰，结果如图6与图7所示，通过耐盐性分析发现，发生在myb30的k283位点上的sumo化修饰对其在植物耐盐性方面的功能至关重要。同时，盐胁迫一般会引起植物细胞内氧化还原稳态失衡，所以本发明还进一步检测了不同材料在盐胁迫下植物细胞内的氧化还原稳态，以探究myb30在调节植物耐盐性过程中的具体机制。

三、胁迫条件下生理响应差异分析

1.myb30在盐胁迫下调节植物氧化还原稳态

在遭受盐胁迫时植物体内会积累过多的ros，从而对细胞造成严重的氧化损伤，测定氧化应激诱导的靶标基因defl的表达可反映植物遭受的氧化胁迫程度。取10天大的col-0、myb30-2、com#1和mcom#2幼苗用100mmnacl处理指定时间，检测defl基因的转录表达水平，结果如图8所示；进一步的，本发明采用h2dcfda染色法测定不同材料中细胞内ros的积累水平，具体步骤如下：选取5天大的col-0、mvb30-2、com#1和mcom#2幼苗，使用200mmnacl处理6h或不处理，使用用含1％乙醇的100μmh2dcfda浸泡孵育20min，后用无菌水清洗三次，用滤纸吸干水分，在荧光显微镜下观察染色结果，bar＝1mm，结果如图9所示。从图中可以看出在盐处理之后，ros积累水平均有增强，其中myb30-2体内的ros水平高于col-0，且野生型回补材料com#1能够将myb30-2体内的ros积累水平恢复到和col-0相似的水平，但点突回补材料mcom#2则与myb30-2体内的ros水平相似。

2.myb30直接调节植物对氧化胁迫的耐受性

通过外施ros诱导剂甲基紫精(methylviologen，mv)可改变植物内源的ros含量。随着加入的dmtu浓度的增加，myb30-2和mcom#2植株的生长情况显著差于col-0及com#1植株(图10与图11)。

上述分析表明转录因子myb30在植物响应盐胁迫信号通路中发挥着关键的作用，且myb30的sumo化修饰对植物耐盐性必需的；myb30对植物耐盐性的调节作用可能与其对氧化胁迫下应答存在紧密的功能联系。由此可知，myb30基因参与正调节植物的耐盐性，其功能发挥能够提高植物的盐耐受力。本发明提供了一种新的提高植物耐盐性的关键基因myb30，其在植物转基因工程及作物改良中具有很好的应用前景。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110>四川大学

<120>一种可提高植物耐盐性的基因及其应用

<141>2019-12-03

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>971

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggtgaggcctccttgttgtgacaaaggaggagtgaagaaagggccatggactcctgaa60

gaagatatcattttagtcacttacatccaagaacatggtcctggtaattggagagctgtt120

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agtggttgtttgaggattctggtggacagattggtgatattctattggatgaaaacacta960

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<210>2

<211>322

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metvalargproprocyscysasplysglyglyvallyslysglypro

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