硫酸软骨素ABC复合酶及应用的制作方法

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种硫酸软骨素abc复合酶及应用。

背景技术：

硫酸软骨素(chondroitinsulfate,cs)是以d-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2脱氧硫酸-d-半乳糖通过β-1,3糖苷键相结合的二糖为基本单位，聚合而成的一类大分子多糖。其为一种酸性粘多糖类生物大分子，聚合度一般在50-70之间，分子量为5-50kd。根据其分子量与结构不同，天然来源的硫酸软骨素有多种分类，常见的为硫酸软骨素a（4-硫酸软骨素）、硫酸软骨素b（硫酸皮肤素）、硫酸软骨素c（6-硫酸软骨素），还有硫酸软骨素d、e、f、h、k、l、m等。硫酸软骨素酶(chondroitinase，简称为“chsase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(δdi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为chsaseabc、chsaseac、chsaseb及chsasec等类型。

目前，chsaseabc为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶，理论上可以对各种类型的硫酸软骨素进行切割。经研究发现，chsaseabc发挥作用的效果与底物种类的复杂程度有密切关系，当底物中硫酸软骨素的种类越多，chsaseabc发表现出的活性越低（实验数据结果参见表1，其中，该表中的“cs”为硫酸软骨素的缩写）。而企业中使用的天然硫酸软骨素底物均为硫酸软骨素a、硫酸软骨素c与硫酸软骨素b（也称之为硫酸皮肤素）的混合物。因此，需要提高chsaseabc在混合底物中的酶切作用。

表1chsaseabc对不同底物的酶活数据

技术实现要素：

有鉴于此，本发明确有必要提供一种硫酸软骨素abc复合酶及应用，该硫酸软骨素abc复合酶可以提高对底物的裂解效率，尤其是对混合底物具有较好的裂解效率。

具体地，本发明采取如下技术方案：一种硫酸软骨素abc复合酶，包括硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii。其中，所述硫酸软骨素酶abci为内切酶，所述硫酸软骨素酶abcii为外切酶。

基于上述，所述硫酸软骨素酶abci和所述硫酸软骨素酶abcii的酶活力比为(1～10):(1～10)。具体可以为1:1、10:1、1:10、1:2、3:1、4:1等。

基于上述，所述硫酸软骨素酶abci和所述硫酸软骨素酶abcii的酶活力比为(1～5):(1～5)。更优选地可以4:1、3:1、1:1、1:3、1:4等。简而言之，优选地，硫酸软骨素酶abci的酶活力应大于等于硫酸软骨素酶abcii的酶活力。

基于上述硫酸软骨素abc复合酶，为固定化酶，还包括固定所述硫酸软骨素酶abci和所述硫酸软骨素酶abcii的固定载体。

基于上述，所述固定载体为具有纳米花结构的磷酸钙。

基于上述，所述固定化酶主要通过以下方法制得：将pbs缓冲液、氯化钙溶液、硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii均匀混合后，过夜静置，然后离心、过滤处理，制得所述固定化酶。

本发明还提供一种上述硫酸软骨素abc复合酶的应用，包括：利用上述硫酸软骨素abc复合酶裂解硫酸软骨素。

基于上述应用，包括：在ph为7～9和温度为32～42℃的条件下，采用上硫酸软骨素abc复合酶裂解所述硫酸软骨素。

在本发明提供的硫酸软骨素abc复合酶中，硫酸软骨素酶abci为内切酶，其在裂解底物的过程中采用随机的内切机制，如图1所示，硫酸软骨素酶abci随机裂解底物硫酸软骨素长链分子中的β-1,4糖苷键，具有多个酶切位点；硫酸软骨素酶abcii为外切酶，其在在裂解底物的过程中采用严谨的外切机制，如图2所示，硫酸软骨素酶abcii只能从一端依次裂解硫酸软骨素二糖之间的β-1,4糖苷键。本发明中硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii配合使用，在裂解反应方法上类似于级联反应，硫酸软骨素酶abci将大分子量裂解成分子量较小的硫酸软骨素多糖，为硫酸软骨素酶abcii提供更多的结合位点，从而实现高效裂解硫酸软骨素。所以，本发明提供的硫酸软骨素abc复合酶具有协同增效作用，既突破了硫酸软骨素abci更偏向于大分子的结合的限制，又突破了硫酸软骨素abcii对裂解速度的限制。因此，利用本发明提供的硫酸软骨素abc复合酶可以有效提高裂解底物硫酸软骨素的效率及活性。

进一步，本发明提供的硫酸软骨素abc复合酶为固化酶，尤其是具有纳米花结构的磷酸钙体系的固化酶，可以显著提高硫酸软骨素abc复合酶的活性，进而显著提高硫酸软骨素酶abc对混合底物的裂解效率。

附图说明

图1为硫酸软骨素酶abci对底物的裂解机理示意图，其中，该图中的“abci”代表硫酸软骨素酶abci。

图2为硫酸软骨素酶abcii对底物的裂解机理示意图，其中，该图中的“abcii”代表硫酸软骨素酶abcii。

图3为本发明实施例提供的固定化硫酸软骨素abc复合酶的循环利用效果柱状图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

本发明中采用的硫酸软骨素酶abci和abcii来源于普通变形杆菌(proteusvulgaris)，下面各实施例中利用现有融合蛋白技术在大肠杆菌中高效表达了来源于proteusvulgaris(kctc2579)的硫酸软骨素abc酶ⅰ（chsaseabcⅰ）和硫酸软骨素abc酶ⅱ（chsaseabcⅱ），并对重组酶进行了纯化。

本发明提供的硫酸软骨素复合酶中的硫酸软骨素酶abci和abcii的酶活力比以及复合酶的形态是影响复合酶的活力以及裂解底物的效率的重要因素。

（1）复合酶裂解效果验证试验

通过在相同条件下，改变各对比例和实施例中硫酸软骨素酶abci（以下表2和表3中简写“abci”）和/或abcii（以下表2和表3中简写“abcii”）两者的酶添加量和反应时间，并使用hplc方法分别检测反应结束时产生的二糖等小分子量产物峰面积，将硫酸软骨素酶abci添加0.1iu，反应20min后的产物峰检测面积算做100%，其他的与之做比较。其中，本次试验采用的复合酶为游离硫酸软骨素abc复合酶，主要是按照表2的使用量将硫酸软骨素酶abci和abcii均匀混合制得。

酶活测定方法：以ph7.4的pbs缓冲液进行硫酸软骨素酶活测定，以鲨鱼来源的硫酸软骨素ac混合物为底物，终浓度为1mg/ml，应体系为1ml，酶添加量为100μl，反应温度为37℃，测定其在232nm下的吸光度变化。

裂解试验方法：取浓度1mg/ml和ph值7.4的源于鲨鱼的硫酸软骨素ac，置于37℃水浴保温10min后，加入实施例1-6所述的自由硫酸软骨素复合酶abc和固定化硫酸软骨素复合酶abc，在室温（37℃）下振荡酶解20min后采用液相色谱法进行检测，根据峰面积确定硫酸软骨素二糖含量，并以某一实验组为相对定量，结果如表2所示。其中，表2中的“以c为底物相对裂解效率”是指以硫酸软骨素c为底物的相对裂解效率；“以a为底物相对裂解效率”是指以硫酸软骨素a为底物的相对裂解效率。

液相色谱检测法：色谱柱为watershypersilsax强阴离子交换色谱柱；

流动相aph3.5盐酸水溶液，流动相bph3.5盐酸2m氯化钠；

梯度洗脱0-4min，100%a；4-45min，50%a；45-50min，100%a；柱温40℃。

表2硫酸软骨素单酶与复合酶作用效果比较

从表2中可以看出：通过对比例1与对比例2的比较发现，单独增加硫酸软骨素酶abci的使用量，裂解效率没有明显提升，以硫酸软骨素c为底物裂解效率从100%升到107.85%，以硫酸软骨素a为底物裂解效率从100%提升到116.36%。通过对比例2与对比例3的比较发现，单独增加硫酸软骨素酶abci的反应时间，以硫酸软骨素c为底物裂解效率分别为107.85%、97.29%，略有下降；以硫酸软骨素a为底物裂解效率分别为116.36%、115.89%，几乎不变；从总体上而言，以硫酸软骨素为底物，裂解效率变化不大。同样对比例4和对比例5的比较，可以看出单独增加硫酸软骨素酶abcii的使用量，裂解效率不佳，通过对比例5与对比例6的比较可以发现，单纯的增加硫酸软骨素酶abcii的反应时间，裂解效率也没有明显改变。但是通过对比例2、对比例5和实施例1的比较，可以看出将硫酸软骨素酶abci与硫酸软骨素酶abcii复合使用，裂解效率明显增加，以硫酸软骨素c为底物裂解效率提升到了243.58%，以硫酸软骨素a为底物提升到了271.44%。由此可见，硫酸软骨素酶abci与硫酸软骨素酶abcii的复合使用与分别单独使用相比，裂解效率有显著增加，两者有明显的协同效应。

从实施例2～5可以看出：不同比例的硫酸软骨素酶abci与硫酸软骨素酶abcii对底物的裂解效果有影响。从上面各试验结果来看：可以认为本发明实施例提供的硫酸软骨素复合酶abc，在裂解底物方法上，硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii类似于级联反应；在裂解底物的反应机理上，硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii协同作用，硫酸软骨素酶abci先将大分子量裂解成分子量较小的硫酸软骨素多糖，为硫酸软骨素酶abcii提供更多的结合位点，既突破了硫酸软骨素abci更偏向于大分子的结合的限制，又突破了硫酸软骨素abcii对裂解速度的限制，从而实现高效裂解硫酸软骨素。

（2）固定化复合酶与游离复合酶的裂解效果比较试验

固定化硫酸软骨素复合酶abc主要采用磷酸氢钙体系固定硫酸软骨素abc酶，具体方法包括：提供反应液a：ph7.4的pbs缓冲液，反应液b：0.1m氯化钙溶液；构建反应体系：总体积100μl的对应酶活的硫酸软骨素酶abci和硫酸软骨素酶abcii，100μl所述反应液b，800μl所述反应液a，4℃过夜反应，反应后12000rpm离心，上清为残余游离酶，沉淀为固定化酶，沉淀再用超纯水洗涤离心3次，最终沉淀为固定化硫酸软骨素复合酶abc。该固定化酶主要由硫酸软骨素酶abci、所述硫酸软骨素酶abcii、以及固定硫酸软骨素酶abci和所述硫酸软骨素酶abcii的具有纳米花结构的磷酸钙组成。以源于鲨鱼的硫酸软骨素ac为底物，将硫酸软骨素酶abci与硫酸软骨素酶abcii进行双酶固定化得到的固定化复合酶与游离复合酶分别进行裂解实验，同样采用hplc检测裂解产物，以产物的峰面积作为比较的对象，具体试验条件与前述“（1）复合酶裂解效果验证试验”相同。结果如表3所示。

表3固定化复合酶与游离复合酶裂解效果比较

从表3中可以看出：固定化后的硫酸软骨素abc复合酶对不同底物的活力均有一定的提升，其中，对硫酸软骨素a的活力提升至游离复合酶的256.27%，提升较大。固定化后的硫酸软骨素abc复合酶的稳定性优于游离硫酸软骨素abc复合酶，且可方便回收，降低使用成本。

（3）固定化复合酶的循环利用试验

参照前述“（1）复合酶裂解效果验证试验”，对实施例7提供的固定化的硫酸软骨素abc复合酶进行以源于鲨鱼的硫酸软骨素ac为底物的裂解实验；每次实验结束对裂解产物进行hplc的检测，同时将固定化复合酶进行回收，将回收的复合酶每次重新以新底物进行酶解反应；其中，以实施例6提供的游离硫酸软骨素abc复合酶裂解以源于鲨鱼的硫酸软骨素ac的效果作为对比。试验结果如图3所示。

图3中的im1、im2、im3、im4、im5、im6、im7、im8分别代表固定化硫酸软骨素复合酶的循环次数，游离复合酶代表游离硫酸软骨素复合酶。从图3中可以看出：固定化的硫酸软骨素abc复合酶重复使用次数3次（im1，im2和im3）不会有明显的酶活损失；重复使用5次之后，其活性低于游离硫酸软骨素abc复合酶。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。