一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法。

背景技术：

瓠瓜是葫芦科葫芦属的一个栽培种，具有重要的园艺和药用价值。瓠瓜果实可用作蔬菜、容器、装饰品或器具等，其幼苗可作为甜瓜、西瓜、黄瓜等嫁接用砧木。瓠瓜起源于非洲，目前广泛栽培于热带至温带地区。我国瓠瓜栽培历史悠久，主要以嫩果作为蔬菜食用，是我国南方地区重要的瓜类蔬菜之一。

转基因技术是研究瓠瓜基因功能和性状改良的重要手段之一，但是像大多数作物一样，瓠瓜在转基因研究上一直存在着传统转化方法的障碍。传统转化方法主要以根癌农杆菌介导法为主，其次是发根农杆菌介导法。通过根癌农杆菌进行瓠瓜转基因非常困难，目前还未见报道，虽然利用发根农杆菌诱导携带目标基因的毛状根技术在南瓜等葫芦科作物中已得到了应用，但是在瓠瓜上尚未有诱导发状根形成的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述问题，提供一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，包括如下步骤：

(1)获得外植体：首先利用70％酒精对材料进行消毒，无菌水冲洗2-3遍后，播种于生化培养箱中进行黑暗催芽处理，待种子萌发后移栽到基质中并浇透水，置于光照培养箱中培养；待幼苗生长到第6d时，贴近根部将植株切断，获得地上部分作为外植体；

(2)发根农杆菌活化：使用时将发根农杆菌r1000活化、接种、培养，制备侵染用的发根农杆菌菌液；

(3)侵染外植体：取15-30ml的发根农杆菌菌液加入50ml小烧杯中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染后移至生化培养箱中黑暗条件下共培养；

(4)以种子萌发袋为生长载体诱导发状根的形成：以无菌种子萌发袋为生长载体，将发根农杆菌侵染后的外植体沿着种子萌发袋的小孔插入其中，每隔一个小孔插入一个外植体，萌发袋中加入15-30ml的cim培养基，密封保湿，将种子萌发袋置于配套的塑料支撑架上，用泡沫板夹紧；随后放于21℃培养箱内黑暗处理3d，3d后转移至光照培养箱中培养，培养2-4周后即可形成发状根。

进一步地，步骤(1)中，基质是由蛭石、草炭按照3：1的比例配制而成，且在121℃下高压灭菌20min。

进一步地，步骤(2)中，发根农杆菌r1000为携带gus报告基因的双元表达载体pbi121。

进一步地，步骤(3)中，cim培养基含有20％ms和0.4mm乙酰丁香酮。

进一步地，步骤(3)中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染0.5-2h后，移至生化培养箱中黑暗条件下共培养。

进一步地，步骤(4)的整个过程在超净工作台中操作，黑暗处理期间保持植株适度萎蔫。

进一步地，步骤(1)及步骤(4)中，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％。

进一步地，步骤(4)中发状根通过gus染色进行转基因发状根的阳性转化率检测。

进一步地，发状根进行阳性转化率检测时，将各植株上的根系剪下放于盛有gus染色液的离心管里，将离心管置于黑暗条件下，37℃摇床上震荡6-7h，倒出染色液，用无水乙醇浸泡1-3min，重复2-4次脱色处理，最终显示被染成蓝色的根系即为转基因发状根。

本发明的有益效果是：

1、该方法建立的发根农杆菌诱导瓠瓜外植体高效获得瓠瓜组合苗的体系，填补了瓠瓜遗传转化技术的空白，为后续基因功能的研究以及加快瓠瓜育种速度打下基础。

2、利用携带gus报告基因的发根农杆菌菌液侵染，可直接进行gus染色检测，能快速、准确、客观地进行组合苗发状根的阳性检测。

3、利用种子萌发袋为载体，降低了污染的风险，所获得的毛状根系质量高、遗传稳定且所需时间大大缩短。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中外植体于种子萌发袋中时的结构示意图；

图2为本发明中种子萌发袋放置于泡沫板上的结构示意图；

图3为本发明实施例一中种子萌发袋诱导第19天左右时形成发状根的结构示意图；

图4为图3中发状根的实物放大示意图；

图5为本发明中14份不同瓠瓜基因型材料的示意图；

图6为本发明中发状根经gus染色后的示意图；

图7为本发明中瓠瓜基因型材料“长广137”发状根中gus基因pcr检测的示意图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1-外植体，2-种子萌发袋，3-泡沫板，4-发状根。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、生化试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例附图5中的14份瓠瓜(lagenariasiceraria(molina)standl.)材料，公众可从浙江省农业科学院蔬菜所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不作为其它用途使用。

农杆菌为发根农杆菌r1000(agrobacteriumrhizogenesr1000)记载于lam,s.,lam,b.,harrison,l.,&strobel,g,1984.geneticinformationontheriplasmidofagrobacteriumrhizogenesdetermineshostspecificity.plantscienceletters,34(3):345-352。

实施例一

本实施例为一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，包括如下步骤：

(1)获得外植体：挑选成熟且外形完整的瓠瓜种子，首先利用70％酒精对材料进行消毒，无菌水冲洗2-3遍后，播种于26℃生化培养箱中进行黑暗催芽处理，待种子萌发后移栽到基质中并浇透水，置于光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％；待幼苗生长到第6d时，贴近根部将植株切断，获得地上部分作为外植体。其中，基质是由蛭石、草炭按照3：1的比例配制而成，且在121℃下高压灭菌20min。

(2)发根农杆菌活化：选用发根农杆菌r1000，发根农杆菌r1000为携带gus报告基因的双元表达载体pbi121，将-80℃冰箱中保存的携带gus报告基因的双元表达载体pbi121的发根农杆菌r1000甘油菌液在yeb(含50mg/l的rif和50mg/l的kana)培养基上划线活化，然后接种到1ml的yeb培养液中培养，28℃，200rpm，12h。再取200μl发根农杆菌菌液接种到50ml的yeb(含50mg/l的kan)液体培养液，28℃，250rpm；将发根农杆菌菌液培养至od600＝1.0-1.2后，将发根农杆菌菌液置入离心管，室温下离心，弃上清液，加入10mm的cim(含有20％ms和0.4mm乙酰丁香酮)培养基将沉淀重新悬浮至od600＝0.8-1.0。

(3)侵染外植体：取20ml的发根农杆菌菌液加入50ml小烧杯中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染0.5h后，移至21℃生化培养箱中黑暗条件下共培养。

(4)以种子萌发袋为生长载体诱导发状根的形成：以无菌种子萌发袋2为生长载体，将发根农杆菌侵染后的外植体1沿着种子萌发袋2的小孔插入其中，每隔一个小孔插入一个外植体，萌发袋中加入20ml的cim培养基，密封保湿，将种子萌发袋置于配套的塑料支撑架上，用泡沫板3夹紧；随后放于21℃培养箱内黑暗处理3d，整个过程在超净工作台中操作，黑暗处理期间保持植株适度萎蔫。3d后转移至光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％。9d后瓠瓜组合苗根部会长出大量毛状根，此时长出的基本不是转化根，将其剪去，再继续培养会形成根瘤，10d后，可长出大量转基因发状根4，如图3和图4所示，期间适时适量地向种子萌发袋内添加cim培养基。

实施例二

本实施例为一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，包括如下步骤：

(1)获得外植体：挑选成熟且外形完整的瓠瓜种子，首先利用70％酒精对材料进行消毒，无菌水冲洗2-3遍后，播种于26℃生化培养箱中进行黑暗催芽处理，待种子萌发后移栽到基质中并浇透水，置于光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％；待幼苗生长到第6d时，贴近根部将植株切断，获得地上部分作为外植体。其中，基质是由蛭石、草炭按照3：1的比例配制而成，且在121℃下高压灭菌20min。

(2)发根农杆菌活化：选用发根农杆菌r1000，发根农杆菌r1000为携带gus报告基因的双元表达载体pbi121，将-80℃冰箱中保存的携带gus报告基因的双元表达载体pbi121的发根农杆菌r1000甘油菌液在yeb(含50mg/l的rif和50mg/l的kana)培养基上划线活化，然后接种到1ml的yeb培养液中培养，28℃，200rpm，12h。再取200μl发根农杆菌菌液接种到50ml的yeb(含50mg/l的kan)液体培养液，28℃，250rpm。将发根农杆菌菌液培养至od600＝1.0-1.2后，将发根农杆菌菌液置入离心管，室温下离心，弃上清液，加入5-15mm的cim(含有20％ms和0.4mm乙酰丁香酮)培养基将沉淀重新悬浮至od600＝0.8-1.0。

(3)侵染外植体：取15ml的发根农杆菌菌液加入小烧杯中，将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染1h后，移至生化培养箱中黑暗条件下共培养。

(4)以种子萌发袋为生长载体诱导发状根的形成：以无菌种子萌发袋(购自北京启维益成科技有限公司)为生长载体，将发根农杆菌侵染后的外植体沿着种子萌发袋的小孔插入其中，每隔一个小孔插入一个外植体，萌发袋中加入15ml的cim培养基，密封保湿，将种子萌发袋置于配套的塑料支撑架上，用泡沫板夹紧；随后放于21℃培养箱内黑暗处理3d，整个过程在超净工作台中操作，黑暗处理期间保持植株适度萎蔫。3d后转移至光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％。培养2-4周后即可形成发状根，期间适时适量地向种子萌发袋内添加cim培养基。

实施例三

本实施例为一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法，包括如下步骤：

(1)获得外植体：挑选成熟且外形完整的瓠瓜种子，首先利用70％酒精对材料进行消毒，无菌水冲洗2-3遍后，播种于26℃生化培养箱中进行黑暗催芽处理，待种子萌发后移栽到基质中并浇透水，置于光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％；待幼苗生长到第6d时，贴近根部将植株切断，获得地上部分作为外植体。其中，基质是由蛭石、草炭按照3：1的比例配制而成，且在121℃下高压灭菌20min。

(2)发根农杆菌活化：选用发根农杆菌r1000，发根农杆菌r1000为携带gus报告基因的双元表达载体pbi121，将-80℃冰箱中保存的携带gus报告基因的双元表达载体pbi121的发根农杆菌r1000甘油菌液在yeb(含50mg/l的rif和50mg/l的kana)培养基上划线活化，然后接种到1ml的yeb培养液中培养，28℃，200rpm，12h。再取200μl发根农杆菌菌液接种到50ml的yeb(含50mg/l的kan)液体培养液，28℃，250rpm。将发根农杆菌菌液培养至od600＝1.0-1.2后，将发根农杆菌菌液置入离心管，室温下离心，弃上清液，加入15mm的cim(含有20％ms和0.4mm乙酰丁香酮)培养基将沉淀重新悬浮至od600＝0.8-1.0，取30ml的发根农杆菌菌液加入小烧杯中。

(3)侵染外植体：将外植体的茎段切口浸没到菌液中，侵染2h后，移至生化培养箱中黑暗条件下共培养。

(4)以种子萌发袋为生长载体诱导发状根的形成：以无菌种子萌发袋为生长载体，将发根农杆菌侵染后的外植体沿着种子萌发袋的小孔插入其中，每隔一个小孔插入一个外植体，萌发袋中加入30ml的cim培养基，密封保湿，将种子萌发袋置于配套的塑料支撑架上，用泡沫板夹紧；随后放于21℃培养箱内黑暗处理3d，整个过程在超净工作台中操作，黑暗处理期间保持植株适度萎蔫。3d后转移至光照培养箱中培养，光照培养箱的生长参数设置为：温度28℃白天/22℃晚上，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿度60％。培养2-4周后即可形成发状根，期间适时适量地向种子萌发袋内添加cim培养基。

实施例四

gus染色检测：发状根通过gus染色进行转基因发状根的阳性转化率检测，检测时将各植株上的根系剪下放于盛有gus染色液的离心管里，将离心管置于黑暗条件下，37℃摇床上震荡6-7h，倒出染色液，用无水乙醇浸泡2min，重复3次脱色处理，最终显示被染成蓝色的根系即为转基因发状根，如图6所示。

统计每个基因型材料的平均生根数、转化率和诱导率，并进行差异显著分析，按步骤对14个不同瓠瓜基因型材料进行发状根诱导，综合考虑生根数、转化率和诱导率三个指标，获得结果如表1：

表1不同基因型材料的平均生根数、转化率和诱导率

由上表可知，“长广137”植株的发状根中阳性转化率为36.81％±3.47％，是南瓜中报道的转化率的1.6倍(ilinaetal,2012)。

实施例五

pcr检测：本实施例使用植物rna提取试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司]进行根系rna提取，再用反转录试剂盒[购自天根生化科技(北京)有限公司]将总rna反转录为cdna，以cdna为模板，扩增引物序列为gus-f:5'-caacgaactgaactggcaga-3'和gus-r:5'-agaggttaaagccgacagca-3'，进行载体pbi121上报告基因的pcr扩增，pcr反应体系(25μl)为：模板dna10ng，上下游引物各0.5μl(引物浓度10μmol·l^-1)，taq酶0.5u/μl。

pcr扩增条件为：预变性95℃，3min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，40s；35个循环；最终延伸72℃，5min。最后利用1.5％的琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳检测，结果如图7所示，“长广137”植株的部分发状根中扩增出了载体所带的gus基因，说明gus基因在“长广137”植株的发状根中获得了表达。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。