一种轨道再生型DNA步行器及应用的制作方法

本公开属于dna步行器的构建技术领域，具体涉及一种轨道可再生的dna步行器以及该步行器及其在生物传感中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

dna分子机器是一类由dna组装而成的在微米或者纳米尺度上执行类机器行为的分子机器。受益于dna分子独特的性质，如严格的碱基互补配对，优异的识别能力以及高度编程性等，dna分子机器可以被精确控制，并且可以响应多种刺激，进行精细操作。迄今为止，已经构建了各种类型的dna分子机器，包括步行器、镊子、齿轮、转子、传送带等。

其中，dna步行器在响应外部刺激后，可以沿着预先设计的一维、二维或三维轨道自主渐进行走。然而，在已有的dna步行器的设计中，随着步行链的行走，其供步行链行走的轨道会因为链取代而被占位或者水解被消耗而逐渐耗尽，这严重限制了步行器行走的步数，不利于步行器沿着轨道持续运行。

技术实现要素：

基于上述研究背景，本公开报道了一种新式的dna步行器，它可以沿着再生的轨道自主持续行走。不同于已有的轨道耗尽型步行器，该步行器可以通过补给轨道组分来再生用于行走的轨道。其轨道是路轨和路基的组合。具体而言，它是由路基链和路轨链杂交构成的。当步行链沿着轨道行走时，构成轨道的路轨链被消耗，随之释放出路基链，释放出的路基链会继续结合溶液中游离的路轨链构成新的轨道，这就是轨道的再生过程。步行器沿着这样的可再生的轨道行走有效地提高了行走步数，提高了其持续运行性。并且该步行器表现出优异的信号放大能力，可用于目标物的灵敏检测。

基于上述研究成果，本公开提供以下技术方案：

本公开第一方面，提供一种轨道再生型dna步行器，所述dna步行器由金纳米颗粒(aunp)表面连接至少一条步行链及若干条路基链；所述步行链及路基链均为单链dna，步行链的一端与金纳米颗粒连接，另一端为通过封闭链封闭；所述路基链的一端与金纳米颗粒连接；所述轨道再生型dna步行器还包括补充组件路轨链及核酸外切酶，所述路轨链为发卡结构，其5’凹末端和3’端分别修饰荧光基团和猝灭基团。

该轨道再生型dna步行器的运行原理如原理1所示。它包含修饰有数十条路基链和较少量的被封闭链沉默的步行链的aunp，以及大量路轨链，其5’凹末端和3’端分别修饰了fam荧光基团和bhq1猝灭基团。并且路轨链以发夹的形式游离于溶液中，此时荧光被猝灭。路轨链可以与路基链杂交以暴露出原本封于颈部的区域来结合步行链。特定的目标链通过竞争性结合与封闭链形成更稳定的双链从而释放出步行链，激活该步行器。释放出的步行链则会杂交轨道中的路轨链暴露出的区域，形成一个三链复合体。路轨链的3’凸末端变为3’凹末端，从而使得路轨链被核酸外切酶(exoiii)逐步切割消化，导致轨道的消耗。同时释放出步行链和路基链，而被aunp猝灭荧光的荧光基团也被释放出，恢复荧光。然后释放出来的步行链继续结合下一个轨道上的路轨链，而释放出来的路基链则继续与游离的路轨链结合形成新的轨道以供步行链行走。在这个过程中，只要溶液中存在用于补给的路轨链，轨道就可以再生以弥补消耗的轨道，而该dna步行器就可以沿着轨道多周运行。

优选的，所述金纳米颗粒的直径为10～20nm。

优选的，所述金纳米颗粒：步行链：路基链的摩尔比为0.8～1.2:8～12:180～220.

优选的，所述步行链与路基链为硫醇化的dna单链。

优选的，所述路轨链的浓度范围为小于等于1μm。

进一步优选的，所述浓度范围为0-600nm。

本公开提供的轨道再生型步行器，通过路轨链与路基链的不断杂交形成新的轨道来实现轨道再生，技术人员可通过补充路轨链的数量来维持步行链的行走，当待测环境中路轨链的浓度为1μm时达最大的信噪比，当浓度保持在0nm至600nm的范围内，荧光强度随路轨链浓度的增加而成比例地增长，呈现出良好地线性关系，这表明在该范围内轨道的切割和再生是彻底的。

本公开第二方面，提供第一方面所述轨道再生型dna步行器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将硫醇化的路基链及被封闭的步行链加入金纳米颗粒溶液中在室温条件下摇动一段时间。

优选的，所述被封闭的步行链制备方法如下：将步行链和封闭链的混合物在85～95℃中加热8～12分钟，然后缓慢冷却至室温。

优选的，所述路基链：被封闭链锁定的步行链：路基链的比例为0.8～1.2:8～12:180～210。

优选的，所述制备方法还包括：摇动完成后，向混合物中加入tween-20摇动一段时间之后，再向混合物中缓慢加入nacl继续摇动。

进一步优选的，所述tween-20的浓度为0.8～1.2％(体积分数)。

进一步优选的，所述nacl的添加速度为6小时内缓慢添加2mnacl。

进一步优选的，采用pbs洗涤最终混合物。

本公开第三方面，提供第一方面所述轨道再生型dna步行器在制备核酸生物传感器中的应用。

本公开第四方面，提供一种核酸生物传感器，所述传感器采用第一方面所述轨道再生型dna进行信号放大。

本公开第五方面，提供一种核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述轨道再生型dna步行器。

依据该步行器工作原理，本领域技术人员可以设计与待测核酸物质具有更好杂交稳定性的单链作为封闭链，向待测核酸物质中加入该步行器后，所述封闭链由于与待测物质具有更好的杂交稳定性从而与步行器解离释放出步行链。通过控制待测环境中路轨链的数量来控制信噪比，从而确定信号放大倍数。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

本公开提供了一种轨道再生型dna步行器。与已报道的在行走过程中逐步消耗其轨道直至耗尽的dna步行器相比，新型dna步行器可以在步行链行走后，通过将路轨链补充到路基链上来重新生成轨道以保持其移动。这种轨道再生型dna步行器具有多个优势。首先，只要溶液中存在可用于补充的路轨链，就可以在切割后重建轨道，这使dna步行者能够增加步行步数，增强其持续运行性。其次，它比轨道耗尽型dna步行器的速度高一个数量级，从而提高了其工作效率。第三，在步行过程中产生累积信号的特性使步行者能够检测到痕量目标。该dna步行器是获得高持续运行性的dna分子机器的重要一步，并且具有进一步扩展dna分子机器应用的潜力，例如基于dna的灵敏传感，增强的分子成像和快速的药物递送。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为轨道再生型dna步行器的运行原理图；

图2为aunps的表征结果图；

其中，图2a)为紫外-可见光谱图，图2b)为tem图谱。

图3为aunps与dna-aunps的表征结果图；

图3a)为紫外-可见光谱图，图3b)为dls图谱。

图4为路基链的荧光-浓度标准曲线图；

其中，插入图为dtt解离下的路基链的荧光发射光谱图。

图5为轨道再生型dna步行器的可行性分析结果图；

其中，图5a)为荧光光谱图，图5b)为非变性凝胶电泳图。

图6为轨道再生型dna步行器的运行性能分析结果图；

其中，图6a)为荧光强度的增加与路轨链浓度的关系图，插入图为路轨链浓度范围为0-600nm时，荧光强度的增加与路轨链浓度的线性关系图；

图6b)为轨道再生型dna步行器与轨道耗尽型dna步行器的运行时间的比较。

图7为检测灵敏的比较结果图；

其中，图7a)为轨道再生型dna步行器的荧光光谱，目标物浓度范围为0.01pm–500pm，插入图为荧光强度与目标物浓度对数之间的线性关系；

图7b)为轨道耗尽型dna步行器的荧光光谱，目标物浓度范围为0.5pm-1000pm，插入图为荧光强度与目标物浓度对数之间的线性关系。

图8为轨道再生型dna步行器的分析性能结果图；

其中，图8a)为特异性，图8b)为缓冲液与10％血清的检测对比。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中的不足，本公开提出了一种轨道再生型dna步行器及应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.1化学品与试剂

所有寡核苷酸均购自上海生工生物技术有限公司，其序列列于表1中。使用的外切酶iii(exoiii，浓度为100000uml^-1)购自newenglandbiolabsltd.(中国北京)。所使用的所有化学试剂均为分析纯度，且在使用过程中无需进一步纯化。在整个实验过程中，均使用18.25mωcm的milli-q超高纯水。

表1.该工作中使用的寡核苷酸序列

[a]genbank:af086833.2.[b]genbank:ku182911.1.[c]genbank:fj968794.1.[d]genbank:mf540570.1.[e]genbank:mh121167.1.

1.2仪器

用u-2910紫外可见分光光度计(日本)记录紫外-可见吸收光谱。在日立f-7000荧光分光光度计(日本)上收集荧光发射光谱。其激发波长为488nm，发射光谱范围在510至650nm之间。金纳米颗粒(aunp)的尺寸通过jsm-6700f透射电子显微镜(日本)和zetasizernanozs(英国)记录。page凝胶成像由gekdoctmxr⁺成像系统(美国)完成。

2.1制备轨道再生型dna步行器

根据柠檬酸钠还原法，首先合成了13nm的aunp。根据519nm处的吸光度和相应的摩尔消光系数2.7×10⁸mol^-1dm³cm^-1计算出合成的aunps浓度。然后，将合成的aunps被硫醇化的dna官能化。简而言之，将步行链和封闭链的混合物在90℃中加热10分钟，然后缓慢冷却至室温。将路基链和被封闭链锁定的步行链的混合物以1：10：200(aunps：步行链：路基链)的比例添加到aunps溶液中，然后在室温下摇动16小时。之后，向混合物中添加1％的tween20，使其最终浓度为0.05％，以减少aunps的吸附和聚集。摇动30分钟后，在6小时内将2mnacl缓慢添加至混合物，使其最终浓度为0.2m，然后摇动24h。最后，将所得溶液使用pbs在12,500rpm下洗涤30次，每次30分钟，以去除游离的dna，并复溶于200μlpbs中，以进行后续实验。将该溶液在4℃下避光保存。

2.2aunps的合成与表征

利用柠檬酸钠还原法制备了aunps，并通过紫外-可见光谱和透射电子显微镜(tem)对其进行了表征。如图2所示，合成的产物在519nm处具有强的紫外吸收峰，呈球形，直径约为13nm。这些结果表明成功合成了13nm的aunps。

2.3dna-aunps的制备与分析

将硫醇化的dna链功能化到合成的aunps，并通过紫外-可见光谱和动态光散射(dls)对其进行了表征，如图3所示，产物在523nm处有强的紫外吸收峰并且水合半径变大，说明成功制备了dna-aunps。

2.4确定aunp上路基链的数量

为了确定每个aunp上路基链的数量，首先使用dtt从aunp中释放出修饰的路基链。然后，将溶液以12,500rpm离心30分钟。通过荧光测量包含释放的路基链的上清液。根据路基链荧光标准曲线和上清液的荧光获得aunp上修饰的路基链的浓度。最后，通过将其浓度除以aunp浓度获得每个aunp上路基链的平均数量。如图4所示，利用荧光分析测试了解离下的路基链的荧光强度，计算得到每个aunps上功能化了44条路基链。

3.1轨道再生dnawalker的可行性研究

为了研究轨道再生型dna步行器的可行性，需要40μl的溶液，其中包含0.5nmdna-aunps，0.5nm目标，1μm路轨链和1×tris-hcl缓冲液(ph7.0、20mmtris，100mmnacl，1mmmgcl2)在37℃下孵育。然后加入50uexoiii，将混合物再孵育40分钟。对照试验中不含目标物。为了进行比较，构建了一个轨道耗尽型dna步行器。除使用22nm轨道链外，其他实验条件与轨道再生型dna步行器相同，然后进行荧光测量。

为了研究荧光的增加是否是由于步行链沿轨道的移动而引起的，进行了天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)实验。page凝胶(15％)在1xtbe缓冲液中，4℃，30ma恒定电流的条件下运行2小时。在黑暗中用1×sybrgold染色40分钟后，用gekdoctmxr⁺成像系统对page凝胶成像。

3.2轨道再生型dna步行器的运行评估

轨道再生型dna步行器的可持续运行可以从两个方面进行评估，一个是通过路基链和路轨链的杂交实现轨道再生而导致的路轨链浓度依赖性荧光信号增加，另一个是运行时间。为了评估轨道的再生，本实施例首先测量了荧光强度随路轨链浓度的增加的变化情况。50μl样品溶液在1×tris-hcl缓冲液(ph7.0，20mmtirs，100mmnacl，1mmmgcl2)中包含0.5nmdna-aunps，0.5nm目标，50uexoiii和浓度在0至1.5μm范围内的路轨链。然后，通过测量随时间变化的荧光增加，测试了两种类型的dna步行器，包括轨道再生型dna步行器和轨道耗尽型dna步行器的运行时间。

3.3轨道再生型dna步行器的分析性能评估

本实施例利用ebola病毒基因片段作为模型进行了轨道再生型dna步行器用于分析的灵敏度，特异性和在人血清中的可行性的研究，以显示其作为分析工具之一的巨大适用性。

3.4机器可行性验证

为了验证该机器的可行性，进行了荧光表征。如图5a所示，当步行器被目标触发时，信号增加了783％±10％。为了进行比较，定义了一个轨道耗尽型dna步行器，在该步行器中，路轨链与路基链以1：1的比例杂交，形成了非再生轨道。因为在每个aunp上修饰了44条路基链，且考虑到操作中所用的aunp浓度(～0.5nm)，故使用22nm的路轨链来构建轨道耗尽型dna步行器。结果表明，在相同条件下，轨道耗尽型dna步行器仅获得124％±5％的信号增加。轨道再生型dna步行器的信号增强量是轨道耗尽型dna步行器的6.3倍，这表明路基链重新杂交了路轨链以再生轨道，从而使步行器可以移动多圈。然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)。与单独的dna标记相比(图5b，条带1至5)，添加exoiii后，路轨链保持其完整性(图5b，条带6)，表明其抗具有抗酶切性。在没有路基链的情况下，步行链和路轨链保持独立(图5b，条带7)，而在添加路基链后，出现了两个迁移速率不同的新条带(图5b，条带8)。这表明了轨道和三链复合物的形成，并确认了步行链在行走过程中只能结合完整的轨道。当存在exoiii时，分别对应于路轨链、轨道以及三链复合物的条带消失，但出现了步行链的条带(图5b，条带9)，这表明进行了轨道的再生，并且步行链可以重复沿着轨道移动。

3.5机器持续运行性能分析

由于路轨链是轨道重建的补充组件，因此在最佳条件下研究了其对dna步行器可持续运行的影响。如图6a所示，随着路轨链浓度从0增加到1.5μm，荧光强度逐渐增加，直到1μm时达到平台。依赖于路轨链浓度的荧光增加表明可以通过剂量补充路轨链来维持dna步行器沿着轨道移动。路轨链不断地与空的路基链杂交，形成新的轨道以补偿消耗的轨道，从而保持了dna步行器的运行。特别是，在路轨链浓度为0nm至600nm的范围内，荧光强度以良好的线性随浓度的增加而成比例地增加，这表明在该范围内轨道的切割和再生是彻底的。

行走时间与步行步数成正比，因此行走时间的长短可以反映dna步行器的运行持续性。如果运行时间较长，dna步行器的持续运行性会更好。图6b显示了轨道再生型dna步行器的典型动力学曲线。一旦dna步行器被激活，荧光就会迅速增加，并在40分钟时达到平稳状态。相比之下，轨道耗尽型dna步行器仅运行15分钟，几乎比轨道再生型dna步行器低3倍。显然，轨道再生型dna步行器的持续运行性更好，这归因于轨道的再生增加了dna步行器的行走步数。此外，速度的提高是轨道再生dna助步器所具有的特征。初速率是通过计算前5分钟内每1分钟消耗路轨链量确定的。经过计算，轨道再生型dna步行器的初速率为1.05×10^-11m·s^-1。相比之下，轨道耗尽型dna步行器的初速率为1.32×10^-12m·s^-1，低了一个数量级。它们速度的差异可以通过酶-底物中间假设来解释。在酶浓度一定的条件下，酶促反应的速率正相关于酶-底物复合物的量。对于轨道再生型dna步行器，exoiii所作用的轨道中的路轨链的数量要多于轨道耗尽型dna步行器，因此产生了更快的速率。高速率也有助于增加运行步数，并且提高工作效率，从而可以在同一时间内获得更多的荧光。

3.6机器用于检测的分析性能分析

作为一种在行走过程中产生累积荧光的信号放大器，dna步行器可以有效产生大量信号以进行灵敏分析。在这里，埃博拉病毒基因片段被用作模型来测试轨道再生型dna步行器的检测性能。埃博拉病毒是一种高度传染性和急性致死性病原体，通过与被感染的人和其他动物的体液(例如血液)接触而传播。它的死亡风险很高，尤其是最广泛，最致命的扎伊尔埃博拉病毒(ebov)而言，它可以导致80％以上的死亡率。灵敏的ebov检测对于早期诊断和增加生存率至关重要。

该轨道再生型dna步行器用于生物分析是灵敏而特异的。图7a显示了加入浓度为0.01pm至500pm的ebov基因片段后，轨道再生型dna步行器的荧光发射光谱。根据背景的三倍标准偏差原则可以得到其检测限为3.5fm。相比之下，当使用轨道耗尽型dna步行器进行检测时，检测限为90.7fm。轨道再生型dna步行器的灵敏度比轨道耗尽型dnawalker高20倍以上，这表明其在信号放大方面的优势以及潜在的灵敏检测能力。此外，与报道的埃博拉病毒基因检测方法相比，这种轨道再生型dna步行器检测方法的灵敏度更高(表s2)。为了评估轨道再生型dna步行器用于检测的特异性，在相同条件下测试了其他四种类型的埃博拉病毒基因片段，包括sudan病毒，bundibugyo病毒，forest病毒和restom病毒，作为对照。如图8a所示，所有对照组的荧光信号保持与空白相同，而在ebov存在下得到明显的信号增加。该结果表明，轨道再生型dna步行器具有优异的特异性。

表2.已有检测ebola病毒基因片段的方法对比

轨道再生型dna步行器测定法在生物样品检测中可行。图8b显示在10％的人血清中三种不同浓度的ebov基因片段(0.1pm，1pm，50pm)的回收率分别为107.6％，102.5％和103.8％，相对标准偏差为5.7％，4.7％和分别为2.2％。该结果表明，轨道再生型dna步行器可以抵抗人类血清的干扰，这是其dna成分的局部密度更高和金纳米颗粒周围的局部盐浓度增加所致。该步行器显示出用于生物样品巨大的潜力。

3.7关于该步行器用于检测时控制倍数的方法

步行器的信号增加是与路轨链的量有关，因此通过控制路轨链的量来控制信噪比，在本公开中使用1μm的路轨链量来得到最优的信噪比。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。