一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，特别是一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用。

背景技术：

近年来，随着城市化、工业化进程加快及农业集约化发展，土壤重金属污染问题日益加剧，且污染种类越来越复杂，从传统的单一重金属污染逐步发展成多种重金属复合污染，严重危害食品安全并威胁人类健康，已成为影响我国社会、经济发展的重要环境问题。无论是植物正常生长发育的必需重金属元素，还是非必需重金属元素，只要浓度超过一定范围，就会对植物产生毒害作用。重金属进入植物并积累到一定程度，植物就会表现出毒害症状，如生长缓慢、植株矮小、退绿、产量下降等。这既不利于污染区域景观绿化，也给重金属污染土壤植物修复技术的实施增加了困难。

重金属污染物在土壤中具有移动性差、滞留时间长、不能被微生物降解等特点，治理和修复难度大。植物修复技术以其绿色环保、操作简单、适用性广、成本低、不造成二次污染、环境扰动小、不破坏污染区域土壤结构、符合生态发展规律等优点成为研究热点。但植物修复技术在实施过程中也存在一定局限性，如富集植物生长缓慢、生物量小、重金属富集量低、环境适应性差等。自然环境中，特别是重金属污染土壤中存在大量耐重金属的微生物资源，具有促进植物修复重金属污染土壤的潜力。耐重金属微生物一方面可以通过吸附和累积重金属达到降低土壤中重金属毒性或回收有经济价值重金属的效果；另一方面可以通过代谢活动或代谢产物促进土壤重金属转化为可溶态或交换态等生物活性高的形态，促进植物吸收富集，提高植物修复效率；此外，一部分耐重金属微生物还可以通过分泌生长素(如吲哚乙酸)、1-氨基-1-羧基环丙烷脱氨酶(accd)以及溶磷作用等促进植物的生长，增加植物生物量，以提高植物修复效率。

2014年我国环境保护部和国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》指出，全国土壤总的超标率为16.1％，污染类型以无机型为主，其中镉、铜、铅、铬的点位超标率分别达到7.0％、2.1％、1.5％、1.1％。因此，针对我国土壤重金属污染程度严重化、种类复杂化、复合污染越来越多的状况，筛选出耐多种重金属，特别是耐高浓度镉、铜、铅、铬，并产吲哚乙酸，促进植物生长的微生物，这既利于重金属污染土壤和水体的植被景观恢复，又可构建植物-微生物联合修复体系，促进植物对重金属的吸收富集，继而通过回收植物达到去除土壤或水体中的重金属污染物的目的，但至今未见有公开报导。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用，可有效解决耐高浓度镉、铜、铅、铬，并产吲哚乙酸(iaa)，促进植物生长的问题。

本发明解决的技术方案是，一种耐多重重金属促植物生长的菌株cd103，分类命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，于2019年1月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号cgmccno.17128，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

该菌株在制备菌剂中的应用，所述的菌剂包括固体菌剂和液体菌剂，在耐多重的重金属污染水体和土壤，并分泌吲哚乙酸，促进植物生长和根系发育的应用；

所述的植物为小麦、东牧70黑麦、一年生黑麦草或多年生黑麦草。

本发明菌株cd103具有耐高浓度镉、铜、铅、铬，并产吲哚乙酸，促进植物生长之功效，有效用于多重重金属污染土壤的修复，使用方便，效果好，经济和社会效益显著。

附图说明

图1是本发明菌株cd103的菌落图。

图2是本发明菌株cd103产吲哚乙酸的比色反应图。

图3是本发明菌株cd103在重金属胁迫土培条件下对东牧70黑麦成活率的促进效果图。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明以重金属污染区域表层土壤为材料，以含重金属的lb培养基为筛选培养基进行筛选，分离耐性菌株，然后在不同浓度镉、铜、铅、铬胁迫下培养耐性菌株，确定菌株耐受重金属种类及最高耐受浓度。通过salkowski比色法定性和定量测定耐重金属菌株产吲哚乙酸能力，并利用形态学和分子生物学方法对耐性菌株进行鉴定，由此筛选出一株耐受高浓度镉、铜、铅、铬，并分泌吲哚乙酸，促进植物生长和吸收重金属的微生物菌株cd103，分别命名为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，于2019年1月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号cgmccno.17128，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌株的菌落为圆形，边缘整齐，不透明，表面干燥，无光泽，菌落颜色初期为白色，培养数日后变为乳白色，16srdna序列分析结果表明，该菌为芽孢杆菌；

菌株cd103序列表

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本发明所述的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)cd103制备的菌剂，包括液体菌剂和固体菌剂。

本发明所述的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)cd103在重金属污染水体和重金属污染土壤中促进植物生长和根系发育中的应用。

本发明所述的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)cd103在重金属污染水体和重金属污染土壤修复方面的应用。

本发明所述的重金属优选镉、铜、铅、铬中的任意一种或多种。

本发明所述的植物为小麦、东牧70黑麦、一年生黑麦草、多年生黑麦草。

该菌株能在高浓度镉、铜、铅、铬条件下生长，且可分泌吲哚乙酸，有效促进植物生长及其对重金属的吸收，在镉铜铅铬胁迫水培条件下，接种该菌可以促进小麦发芽；在偏酸性的镉、铜、铬复合污染土壤，及偏碱性的重度镉污染土壤，接种该菌可有效促进东牧70黑麦的生长发育及对镉铜铬的吸收。

并经实地试验和测试，效果非常好，有关资料如下：

1、培养基配制

lb液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠5g，加去离子水至1l，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。lb固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，加去离子水至1l，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。

重金属筛选培养基：lb液体及固体培养基中添加镉、铜、铅、铬等重金属，使cd²⁺、cu²⁺、pb²⁺、cr⁶⁺初始浓度分别为0，50，100，200，500，1000，1250，1500，1750，2000mg·l^-1，其中镉源为cdcl2·2.5h2o，铜源为cuso4·5h2o，铅源为pb(no3)2，铬源为k2cro7(注：应称取150℃烘干至恒重的重铬酸钾)。

2、耐镉铜铅铬菌株的筛选

称取采集自成都某重金属污染区域表层0-20cm新鲜土壤样品10g，放入经121℃，20min灭菌的盛有90ml无菌水及少量玻璃珠的250ml三角瓶中，30℃，180rpm摇床震荡30min，静置1min后吸取上清液(此浓度为10^-1)，并经梯度稀释制成10^-3稀释液。将稀释液涂布于含50mg/lcd²⁺的lb固体培养基上，30℃条件下培养1-2d，待长出菌落后挑取单菌落即为初筛耐重金属菌株，将其以含25％甘油的混悬液形式保存于-75℃冰箱中。

将初筛耐重金属菌株接种至灭菌后的lb液体培养基中，30℃,180rpm摇床震荡培养12h获得种子液。将种子液以2％(v/v)的接种量接种到重金属镉、铜、铅、铬筛选液体培养基中，30℃,180rpm摇床震荡培养48-72h，观察菌液浑浊情况，吸取200μl菌液均匀涂布至lb固体培养基，观察菌落生长情况，确定菌株耐受镉、铜、铅、铬最高浓度。最终筛选出一株耐镉、铜、铅、铬能力强的菌株，将其命名为cd103，该菌株耐受镉、铜、铅、铬的最高浓度分别为2000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、1500mg/l。

3、耐重金属菌株形态描述及分子鉴定

高耐镉、铜、铅、铬菌株cd103的菌落形态如图1所示。将筛选出的耐重金属菌株cd103，采用lb液体培养基培养12h，使用omiga细菌dna提取试剂盒提取其基因组dna，使用细菌16srdna通用引物27f和1492r扩增，扩增产物送交华大基因(郑州)有限公司进行测序，测得其16srdna序列见附录。

4、耐重金属菌株产吲哚乙酸能力测定

产吲哚乙酸能力定性测定：将分离获得的cd103菌株接种于含有l-色氨酸(100mg/l)的lb液体培养基，30℃,180r·min^-1摇床震荡培养24h。取100μl菌悬液于白色陶瓷板上，随后滴入100μl的salkowski比色液(1ml0.5mol/lfecl3+50ml35％hclo4)。以未接菌的lb液体培养液做对照，加入等体积的salkowski比色液。将白色陶瓷板放置暗处反应30min，取出观察，颜色变红表示能产生吲哚乙酸，颜色越深表示吲哚乙酸含量越高，菌株cd103产吲哚乙酸的比色反应如图2所示。

产吲哚乙酸能力定量测定：以分析纯的吲哚乙酸配置标准溶液，浓度分别设置为：0，12.5，25，50，75mg/l，绘制标准曲线，线性回归方程为y＝0.0088x+0.0556，r²＝0.992。菌株培养条件同定性测定培养条件，取5ml菌悬液于离心管中，10000rpm离心10min，吸取4ml上清液于试管中，加入4mlsalkowski比色液，置于暗处反应30min，用分光光度计测定其od530值。计算得菌株cd103在培养48h时iaa产量为30.39mg/l。

5、重金属胁迫水培条件下菌株对植物发芽的促进效应

供试小麦品种为百农矮抗58号，选取颗粒饱满、大小均一的小麦种子，用自来水冲洗数次后，用2％的次氯酸钠消毒20min，再用蒸馏水清洗10遍。

菌株cd103接入lb液体培养基培养12h获得种子液，将种子液以1％(v/v)的量接种到600mllb液体培养基中，30℃，180r·min^-1摇床震荡培养72h获得发酵液，将发酵液转移至500ml离心管，10000rpm离心15min，倒掉上清液，菌体经蒸馏水清洗，离心并倒掉上清，重复清洗3遍。采用差减法称取10g(湿重)菌体至烧杯中，加160ml蒸馏水打散均匀制成备用菌液。

用cdcl2·2.5h2o配置不同浓度的cd²⁺溶液，用cuso4·5h2o配置不同浓度的cu²⁺溶液，用pb(no3)2配置不同浓度的pb²⁺溶液，用k2cro7配置不同浓度的cr⁶⁺溶液。

把直径为12cm的培养皿清洗干净，消毒烘干后铺入双层无菌滤纸。每培养皿加入不同浓度重金属溶液18ml，一部分培养皿再加入2ml蒸馏水，另一部分加入2ml备用菌液。使cd²⁺终浓度分别为50mg/l，100mg/l，200mg/l；使cu²⁺终浓度分别为200mg/l，400mg/l，600mg/l；使pb²⁺终浓度分别为200mg/l，400mg/l，600mg/l；使cr⁶⁺终浓度分别为100mg/l，200mg/l，300mg/l。同时设置培养皿中仅加入20ml蒸馏水的空白对照，并设置培养皿中加入18ml蒸馏水和2ml菌液的处理加菌对照。共设置26个处理，每个处理重复3次，共计78个培养皿。

每个培养皿均匀摆放消毒后的小麦种子50粒，置于温度(25±2)℃、光暗比为12h/12h的光照培养箱中进行培养。每天给培养皿中的小麦更换滤纸和处理液，4d后计算小麦发芽率(结果见表1)。结果表明对照处理小麦发芽率最高，添加重金属后小麦发芽率有不同程度降低；针对镉铜铅铬某一种重金属而言，其胁迫浓度越高，小麦发芽率越低；相对于不加菌的重金属胁迫处理，加入菌株cd103后小麦发芽率均有不同程度提高。

表1重金属胁迫下菌株cd103对小麦发芽的促进效应

6、重金属胁迫土培条件下菌株cd103对植物生长及吸收重金属的促进效应

选取颗粒饱满、大小均一的东牧70黑麦种子，先把种子在水中浸泡3-4小时，然后用2％的次氯酸钠消毒20min，再用蒸馏水清洗10遍。消毒后的种子在盛有少量蒸馏水的培养皿中催芽，种子发芽后均匀播种于盛有重金属污染土壤的塑料花盆中培养。所选塑料花盆直径为20cm，高度为16cm，每盆均装2kg重金属污染土壤。所选重金属污染土壤一份采集自江西省贵溪市，一份采集自河南省新乡市，分别记为a土、b土，两份土壤ph值及重金属含量如表2：

表2两种重金属污染土壤ph及重金属含量

菌株cd103培养及添加方式如下：菌株cd103接入lb液体培养基培养12h获得种子液，将种子液以1％(v/v)的量接种到600mllb液体培养基中，30℃，180r·min^-1摇床震荡培养72h获得发酵液，将发酵液转移至500ml离心管，10000rpm离心15min，倒掉上清液，菌体经蒸馏水清洗，离心并倒掉上清，重复清洗3次。采用差减法称取菌体至烧杯中，加15-20ml蒸馏水打散备用。

试验共设置4个处理，每个处理3次重复，分别为：不接菌处理a土(a)、接菌处理a土(a+菌)、不接菌处理b土(b)、接菌处理b土(b+菌)。每盆装重金属污染土壤2kg，施入1g复合肥(n-p2o5-k20：17-17-17≥51％)，并播种100粒催芽后的东牧70黑麦种子，使用无菌注射器吸取打散后的菌液，缓慢分6-8点均匀注射至土壤中，注射深度为距土壤表层4-5cm，接菌量为1g菌(湿重)/kg土，待东牧70黑麦生长8d后再次接菌，接菌量为0.5g菌(湿重)/kg土，两次之和接菌量约为5.01×10⁹cfu/克土。不接菌处理注射相应量的无菌水。东牧70黑麦生长过程中，浇去离子水使土壤含水量为田间持水量的60-70％，各处理浇水量一致。待东牧70黑麦生长至40d时，采集植物样品，数取东牧70黑麦成活数，计算成活率(如图3)，测量株高、根长、地上部分生物量、根系生物量等指标，采用原子吸收分光光度计法测定东牧70黑麦地上部分和根系镉铜铬含量，并计算其地上部分和根系重金属吸收量。

结果表明酸性镉铜铬复合污染土壤添加菌株cd103后，东牧70黑麦的成活率达到对照(a)的6.1倍，碱性重度镉污染土壤添加菌株cd103后，东牧70黑麦的成活率达到对照(b)的5.0倍。与不添加菌株cd103的a(b)处理相比，添加菌株的a+菌(b+菌)处理显著增加了东牧70黑麦的株高、根长、地上部分及根系生物量(表3)。与不添加菌株cd103的a处理相比，添加菌株的a+菌处理下，东牧70黑麦地上部分和根系镉、铬含量略微降低，地上部分和根系铜含量略微增加，但其地上部分和根系镉、铜、铬吸收量均大幅度增加(表4)。与不添加菌株cd103的b处理相比，添加菌株的b+菌处理大幅增加了东牧70黑麦对镉的吸收量，b+菌处理地上部分和根系镉吸收量分别达到b处理的9.7倍和19.8倍，见表5。

表3菌株cd103对东牧70黑麦生长指标的影响

表4镉铜铬胁迫土培条件下菌株cd103对东牧70黑麦重金属吸收的影响

表5重度镉胁迫土培条件下菌株cd103对东牧70黑麦镉吸收的影响

本发明菌株还对一年生黑麦草、多年生黑麦草按上述试验方法进行了试验，也取得了相同和相近似的结果，这里不再一一列举。

试验表明，本发明菌株cd103能在高浓度镉、铜、铅、铬条件下生长，且可分泌吲哚乙酸，有效促进植物生长及其对重金属的吸收，在镉铜铅铬胁迫水培条件下，接种该菌可以促进小麦发芽；在偏酸性的镉、铜、铬复合污染土壤，及偏碱性的重度镉污染土壤，接种该菌可有效促进东牧70黑麦的生长发育及对镉铜铬的吸收，与现有技术相比，本发明具有如下突出的有益技术效果：

1)本发明提供的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)cd103对镉、铜、铅、铬均有很好的耐受性，其耐受镉、铜、铅、铬的最高浓度分别为2000mg/l、1500mg/l、2000mg/l、1500mg/l(lb液体培养基条件下)；

2)本发明菌株cd103可分泌吲哚乙酸，促进植物生长发育；

3)本发明菌株cd103应用范围广，即可在镉、铜、铅、铬污染水体中应用，达到促进植物生长发育的目的，也可在镉、铜、铅、铬单一及复合污染土壤中应用，达到促进植物生长、提高植物吸收重金属量的目的；

4)本发明菌株cd103对土壤酸碱性环境适应性强，即可应用于南方偏酸性重金属污染土壤，也可应用于北方偏碱性重金属污染土壤，有效提高植物修复效率，恢复污染区域植被景观，环境、经济和社会价值显著。

序列表

<110>河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120>一种耐多重重金属促植物生长的菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1489

<212>dna

<213>苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)

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