维氏菌、白斑病毒和链球菌qPCR试剂盒及方法与流程

文档序号:19952392发布日期:2020-02-18 10:50阅读:来源:国知局

技术特征:

1.维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒,其特征在于包括以下引物对和探针:

检测维氏气单胞菌的引物对和探针ave-pro,所述检测维氏气单胞菌的引物对包括seqidno:1所示的上游引物ave-f和seqidno:2所示的下游引物ave-r,所述探针ave-pro的序列为seqidno:7所示;

检测白斑病毒的引物对和探针wssv-pro,所述检测白斑病毒的引物对包括seqidno:3所示的上游引物wssv-f和seqidno:4所示的下游引物wssv-r,所述探针wssv-pro的序列为seqidno:8所示;

检测无乳链球菌的引物对和探针stre-pro,所述检测无乳链球菌的引物对包括seqidno:5所示的上游引物stre-f和seqidno:6所示的下游引物stre-r,所述探针stre-pro的序列为seqidno:9所示。

2.根据权利要求1所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒,其特征在于:所述上游引物ave-f、下游引物ave-r、探针ave-pro、上游引物wssv-f、下游引物wssv-r、探针wssv-pro、上游引物stre-f、下游引物stre-r和探针stre-pro的终浓度为0.2mm到1mm。

3.根据权利要求1或2所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒,其特征在于:所述探针ave-pro、探针wssv-pro和探针stre-pro的5'标记的荧光基团为fam、vic、hex、cy5中的一种,且各个探针的5'标记的荧光基团互不相同;所述探针ave-pro、探针wssv-pro和探针stre-pro的3'标记的淬灭基团为bq1、bq2中的一种。

4.根据权利要求1所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒,其特征在于:该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液,所述酶液由dna聚合酶组成,酶液和反应缓冲液直接采用市售的2xpremixextaq。

5.根据权利要求1所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒,其特征在于:该试剂盒中还包括有阴性对照和阳性对照;所述阴性对照为用0.01mol/l、ph7.2的pbs缓冲盐水;所述阳性对照为维氏气单胞菌、白斑病毒和无乳链球菌pcr扩增产物分别与克隆载体pmd-18-tvector连接,转化大肠杆菌感受态dh5α,获得阳性克隆菌株,并制备质粒pmd18-ave,pmd18-wssv,pmd18-stre作为阳性对照。

6.一种权利要求要求1所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒的检测方法,其特征在于按照以下步骤进行:

(1)提取待测样本核酸,选用商品化的核酸提取试剂盒;

(2)配置扩增反应体系,体系为:17μlpcr扩增反应液,3μl待检核酸模,体系的总体积为20μl;

(3)荧光定量pcr扩增:将pcr管中配制好的扩增反应体系置于荧光定量pcr仪中进行扩增反应,并进行信号采集;

(4)结果判定:分别在相应通道查看扩增曲线,根据扩增曲线判读结果;维氏气单胞菌检测荧光曲线在第一通道查看,若该通道ct值小于36及s型荧光曲线说明维氏气单胞菌检测结果为阳性;白斑病毒的检测荧光曲线在第二通道查看,若该通道ct值小于36及s型荧光曲线说明白斑病毒检测结果为阳性;无乳链球菌的检测荧光曲线在第四通道查看,若该通道ct值小于36及s型荧光曲线说明无乳链球菌检测结果为阳性。

7.根据权利要求6所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒的检测方法,其特征在于:所述pcr扩增反应液包含10μl的2xpremixextaq,各0.5μl权利要求1中所述的引物和探针,2.5μl的无菌水。

8.根据权利要求6所述的维氏菌、白斑病毒和链球菌qpcr试剂盒的检测方法,其特征在于所述扩增反应条件:95℃预变性30s;95℃变性5s后,60℃退火延伸30s并采集荧光信号40个循环。

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