一种基于聚集诱导发光效应的荧光聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及新材料领域，具体地说，是涉及一种粒径可控且便于修饰的基于聚集诱导发光效应的多功能荧光聚合物及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，聚合物荧光纳米粒子在生物医学、光电器件等领域表现出越来越重要的作用与价值。尤其是在生物医学领域，例如癌症的诊断与治疗和细胞成像等方面，对聚合物荧光纳米粒子提出了更高的要求，例如粒子尺寸均一性、表面可修饰性以及粒子结构的稳定性等。目前而言，制备聚合物荧光纳米粒子的方法主要包括以下四种(lik,liub.polymer-encapsulatedorganicnanoparticlesforfluorescenceandphotoacousticimaging[j].chemicalsocietyreviews,2014,43(18):6570)：自组装法、乳化法、聚合法与共沉淀法等。其中，自组装法是将油溶性的荧光分子通过化学方法修饰某种亲水链段，当其分散至水中时，会自发地形成具有荧光性质的胶束，该方法可以获得粒径很小的纳米粒子然而其所制备的荧光纳米粒子稳定性较差。乳化法是将荧光分子溶解于油相中后滴加至含有乳化剂与聚合物的水相溶液中，通过高速搅拌实现纳米粒子的制备，然而该方法存在制备过程易分相以及粒径均一性差且含有大量乳化剂的不足之处。聚合法通常来讲是指乳液聚合的方法，具体是将荧光分子通过化学修饰赋予其双键，随后采用传统的乳液聚合方法制备得到荧光纳米粒子。该方法可以制备出粒子均一稳定的纳米粒子，但是制备得到的纳米粒子表面含有大量的乳化剂，这限制了该方法的广泛应用。共沉淀法是当前制备聚合物纳米粒子的主要途径，具体实施方法为，将荧光分子溶解于水溶性的有机溶剂中，随后将所得溶液滴加至含有水溶性的聚合物溶液中，在超声分散的作用下即可得到荧光纳米粒子，但该方法得到的粒子均一性较差，并且该方法无法得到干燥状态下的粒子。

另一方面，传统的聚合物荧光纳米粒子的制备过程中所使用的荧光剂分子多具有聚集导致猝灭(aggregation-causedquenching)的现象，该现象的存在使得所制备的荧光纳米粒子中荧光分子含量很低，无法获得较高荧光分子负载率的聚合物荧光分子。聚集诱导发光(aggregationinducedemission，aie)现象有效地解决了acq现象的不足，具有aie性质的材料可以在分子聚集的状态下发射出强烈的荧光。

技术实现要素：

为解决当前荧光纳米粒子所存在的诸多问题，以及满足未来在生物医学或工业生产的特殊需求，本发明提出了一种具有优异光学性质的多功能化的基于聚集诱导发光效应的荧光聚合物及其制备方法和应用。

本发明目的之一为提供一种基于聚集诱导发光效应的荧光聚合物，含有式(i)所示的结构式单元：

其中，n＝10～10000，r为具有聚集诱导发光功能的结构基团。

优选地，n＝100～10000，r为含有四苯基乙烯结构的基团。

其中，r更优选自包含有下述任一结构的基团：

本发明目的之二为提供所述基于聚集诱导发光效应的荧光聚合物的制备方法，包括以下步骤：将aie可聚合单元、马来酸酐、苯乙烯、以及任选的交联剂在引发剂存在下进行沉淀聚合反应得到所述荧光聚合物。

优选地，所述制备方法可包括步骤：将aie可聚合单元、马来酸酐、苯乙烯、以及任选的交联剂加入溶剂中，然后加入引发剂，在无氧条件下进行聚合反应，其中聚合温度为40～100℃，聚合反应时间为10min～5h。

根据本发明的一个优选的实施方案中：将aie可聚合单元、马来酸酐、苯乙烯、以及任选的交联剂溶解所需溶剂中，并加入引发剂，通氮除氧10min后，加热开始聚合反应，反应至一定时间后，停止反应，并通过有机溶剂离心洗涤数次后，放入真空烘箱得到干净的聚合物荧光纳米粒子。

所述aie可聚合单元为具有aie性质的可聚合单元，具体是指含有苯乙烯基修饰的具有aie功能的分子，赋予聚合物粒子特定的功能性。

所述aie可聚合单元优选自下式所示化合物中的至少一种：

其中，tpe-v的英文名称为((2-(4-((4-vinylbenzyl)oxy)phenyl)ethene-1,1,2-triyl)tribenzene)；

其中，tpe-vbc的英文名称为(z)-2-((4-(1,2-diphenyl-2-(4-((4-vinylbenzyl)oxy)phenyl)vinyl)phenyl)(phenyl)methylene)malononitrile；

其中，tpe-vtp的英文名称为(z)-2-((4-(1,2-diphenyl-2-(4-((4-vinylbenzyl)oxy)phenyl)vinyl)phenyl)(thiophen-2-yl)methylene)malononitrile。

所述交联剂优选自二乙烯基苯、nn-亚甲基双丙烯酰胺中的至少一种。

所述引发剂没有特别的限定，可选用偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈以及过氧化二苯甲酰等传统的自由基聚合引发剂。

聚合反应进行反应的所述溶剂优选为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸辛酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯等中的一种或多种混合溶剂。

马来酸酐与苯乙烯作为聚合反应的主要单体，苯乙烯与马来酸酐的摩尔比优选为0.01～1.5，更优选为0.01～1.0。

所述aie可聚合单元优选为马来酸酐摩尔用量的0.1％～100％，更优选为0.1％～50％。

所述交联剂用量优选为马来酸酐摩尔用量的0～100％，更优选为0～50％。

所述引发剂的用量为自由基聚合的通常用量，优选为马来酸酐摩尔用量的0.1％～10％，更优选为1％～10％。

本发明方法中，反应温度可以根据目标产物的粒子大小进行调节，优选可调节范围为50～80℃。

所述聚合反应时间优选为10min～2h。

本发明方法中，还可以包括将得到的荧光聚合物用有机溶剂清洗、烘干的步骤。

具体地可以为对反应所得到的聚合物粒子通过有机溶剂进行洗涤，然后烘干，其中所述有机溶剂优选为乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、丙酮、乙醇、异丙醇、乙醚、乙腈、石油醚等一种或多种混合溶剂。

本发明制备方法克服了现有技术中聚合荧光纳米粒子制备方法的不足，如稳定性差、粒子尺寸分布宽、含有大量乳化剂、荧光分子有效负载率低以及无法实现粒子结构设计等，本发明借助沉淀聚合的方法，一步法完成聚合物荧光纳米粒子的制备，所得到的粒子具有超高稳定性、高染料负载率、表面洁净且易于功能化等特点。

本发明目的之三为提供一种所述的荧光聚合物的制备方法得到的基于聚集诱导发光效应的荧光聚合物纳米粒子。

所述荧光聚合物纳米粒子的粒径范围为50nm～700nm，粒径分布范围为0.01～0.15。

本发明目的之四为提供所述的荧光聚合物或者所述制备方法得到的荧光聚合物在免疫调控、细胞标记、材料抗菌、粗糙度检测中的应用。

通过调节改变本发明中的技术手段可以实现一种表面功能化且粒子粒径可控的荧光聚合物纳米粒子的制备，所得到的聚合粒子具有以下特征：

(1)通过该方法制备得到的粒子会经历粒子由小到大的增长过程，因此可以根据聚合反应时间停止聚合反应，以获得粒子粒径可控的聚合物荧光粒子，粒子粒径范围为50nm～700nm，粒径分布范围为0.01～0.15。

(2)聚合过程不额外添加乳化剂，所得到的聚合物荧光粒子表面洁净，不含有任何其他多余成分。

(3)聚合结构中含有马来酸酐，可以通过马来酸酐与蛋白质或其他含有氨基的基团进行反应，实现聚合物粒子的表面功能化。

(4)通过调节聚合过程中具有aie性质的可聚合单元的用量可以实现不同的染料负载率，最高可实现50％的染料负载率。该特点是传统荧光纳米粒子制备方法无法实现的。

(5)聚合物结构中含有具有aie性质的基团，通过改变发光基团的结构可以实现聚合物粒子的功能的改变，例如杀菌功能等。

(6)利用聚合物粒子的粒径可调性，可以制备出简易的粗糙度检测试剂，以应用于一些不便于精密测量的器件或大型设备。

附图说明

图1：实施例1聚合物荧光粒子的红外光谱图。

图2：聚合时间间隔为10min所得到的聚合物粒子电镜照片以及粒子尺寸分布。

图3：聚合物荧光粒子标记自然杀伤细胞的荧光照片。

图4：聚合物荧光粒子测定玻璃粗糙度的荧光照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

本发明具体实施方式中所用原料为市售所得。

实施例中tpe-vbc、tpe-v、tpe-vtp按照z.zhang,p.bilalis,h.zhang,y.gnanou,n.hadjichristidis.corecross-linkedmultiarmstarpolymerswithaggregation-inducedemissionandtemperatureresponsivefluorescencecharacteristics[j].macromolecules2017,50(11):4217；x.cai,d.mao,c.wang,d.kong,x.cheng,b.liu.multifunctionalliposome:abrightaiegen–lipidconjugatewithstrongphotosensitization[j].angew.chem.int.ed.2018,57(50):16396等文献所列举的实验方法制备得到。

实施例1

制备粒径可控的含有aie性质的聚合物粒子：分别配置五组聚合反应液，每组反应液组成成分一致。其中以马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，tpe-vbc0.01g，偶氮二异丁腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸丁酯将以上试剂完全溶解即为一组聚合反应液。将以上五组通氮除氧10min后，放置到50℃水浴锅中进行聚合反应。每间隔10min取出一组聚合反应液，利用乙酸乙酯与石油醚混合溶液离心洗涤三次后，将产物放置到50℃的真空烘箱中，真空干燥后便可得到粒径不同的荧光聚合物粒子(具体如图2所示)，并利用红外光谱仪表征其基本结构，如图1所示。红外光谱中2228cm^-1处为tpe-vbc分子中氰基的特征吸收峰，1781cm^-1处为分子主链中酸酐的特征吸收峰，这表明了tpe-vbc被聚合到了粒子中。

抗菌性试验

取0.1g所得到的荧光聚合物粒子通过超声再分散至10ml0.1m的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)中，然后将其放置10小时后，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液中。向该溶液中再加入10ml金色葡萄球菌悬浮液，通过测定混合溶液在600nm出的吸光度值(od600值)记为混合溶液中金色葡萄球菌的初始浓度。利用光照强度为1kw/m²的氙灯照射30min后，再次测定混合溶液的od600值，通过计算即可得到该聚合物粒子的对金色葡萄球菌的杀伤能力约为87％。

实施例2

制备粒径为500nm的聚合物荧光纳米粒子：取马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，tpe-vbc0.01g，偶氮二异丁腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸丁酯将以上试剂完全溶解。通氮除氧10min后，放置到60℃水浴锅中进行聚合反应。聚合120min后得到粒径约为500nm的聚合物粒子。

蛋白质偶联

取0.1g所得到的荧光聚合物粒子通过超声再分散至10ml0.1m的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)中，然后将其放置3小时后，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液中。随后向混合液中加入0.05g粉末状脂肪酶，放置于37℃摇床中反应60min后将聚合物粒子进行超滤以获得表面偶联脂肪酶的聚合物粒子。通过测定滤液在280nm处的吸光度值，计算出滤液中剩余的脂肪酶含量，从而确定脂肪酶被聚合物粒子偶联效率为70％，并保持了65％的剩余活性。

实施例3

制备粒径为200nm的聚合物荧光纳米粒子：取马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，tpe-v0.087g，偶氮二异庚腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸戊酯将以上试剂完全溶解。通氮除氧10min后，放置到60℃水浴锅中进行聚合反应。聚合20min后得到粒径约为200nm的聚合物粒子。

细胞标记实验

取0.1g所得到的荧光聚合物粒子通过超声再分散至10ml0.1m的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)中，然后将其放置3小时，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液，随后利用pbs缓冲溶液稀释得到10g/ml的聚合粒子分散液。将自然杀伤细胞(nkcells)放置到6孔板中，并在37℃下5％co2含量的细胞培养箱中培养12h。然后将培养后的细胞放置到含有10g/ml的荧光聚合物粒子的分散液中，在co2培养箱孵育1h后利用磷酸盐缓冲溶液离心洗涤三次，利用流式细胞仪测定细胞的标记效率为92.7％。如图3所示，被标记的细胞表现出明显的荧光，并且荧光图像与细胞明场下的照片匹配一致，说明粒子标记在了细胞表面。

实施例4

制备不同荧光染料负载率的聚合物粒子：制备六组聚合反应液，取马来酸酐0.05g，tpe-vtp的用量分别为0.0019g、0.0057g、0.0096g、0.0134g、0.0172g、0.1924g，相应地，苯乙烯用量为0.0386g、0.0412g、0.0403g、0.0395g、0.0386g、0.0005g，过氧化二苯甲酰0.001g，二乙烯基苯0g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸异戊酯将以上试剂完全溶解。通氮除氧10min后，放置到60℃水浴锅中进行聚合反应。反应2h后聚合完成，利用丙酮等有机溶剂洗涤，并真空烘箱中干燥。采用称重法计算反应体系转化率为98％，得到荧光剂负载率为1％、3％、5％、7％、9％、49.9％的聚合荧光粒子。荧光量子产率分别为32.1％、30.5％、33.7％、34.8％、35.7％、36.1％。

实施例5

制备聚合物荧光纳米粒子：取马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，tpe-vbc0.01g，偶氮二异丁腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的丙酸乙酯与乙酸辛酯混合溶液将以上试剂完全溶解。通氮除氧10min后，放置到70℃水浴锅中进行聚合反应。聚合300min后得到粒径约为600nm的聚合物粒子。

粗糙度检测实验

取0.5g所得到的荧光聚合物粒子通过超声再分散至20ml去离子水中并滴加1ml的三乙胺溶液，然后将其放置10小时后，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液中。将一半经过刻蚀而另一半未被刻蚀的玻璃片浸泡在上述分散液中1min，随后将玻璃片取出，再用去离子水洗涤三次后放置到荧光灯下检测其荧光信号。其中未被刻蚀的玻璃不具有荧光，而刻蚀后的玻璃明显出现了荧光信号(见附图4)。

对照组1

将马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，偶氮二异丁腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸丁酯将以上试剂完全溶解。通氮除氧10min后，放置到60℃水浴锅中进行聚合反应。反应2h后，将聚合产物利用乙酸乙酯与石油醚混合溶液离心洗涤三次后，将产物放置到50℃的真空烘箱中，真空干燥后便可得到不含荧光基团聚合物粒子。取0.1g所得到的聚合物粒子通过超声再分散至10ml0.1m的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)中，然后将其放置10小时后，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液中。向该溶液中再加入10ml金色葡萄球菌悬浮液，通过测定混合溶液在600nm出的吸光度值(od600值)记为混合溶液中金色葡萄球菌的初始浓度。利用光照强度为1kw/m²的氙灯照射30min后，再次测定混合溶液的od600值，通过计算即可得到该聚合物粒子的对金色葡萄球菌的杀伤能力仅为0.7％。

对照组2

通过合成设计出一种不含有苯乙烯基修饰的具有aie性质的化合物，tpe-ebc。取马来酸酐0.05g，苯乙烯0.04g，二乙烯基苯0.005g，tpe-ebc0.01g，偶氮二异丁腈0.001g，加入50ml的单口烧瓶中，随后加入10ml的乙酸丁酯将以上试剂完全溶解通氮除氧10min后，放置到50℃水浴锅中进行聚合反应。反应2h后利用乙酸乙酯、丙酮、异丙醇、石油醚依次洗涤数次，随后放置到真空烘箱中干燥，得到物理包裹aie化合物的聚合物粒子。将粒子再次分散至乙酸丁酯中，利用紫外光灯照射，发现该聚合物不具有荧光性质。

tpe-ebc的结构式如式(viii)所示：

其中，tpe-ebc的英文名称为2-((4-(2,2-bis(4-((4-ethylbenzyl)oxy)phenyl)-1-phenylvinyl)phenyl)(phenyl)methylene)malononitrile。

取0.1g所得到的聚合物粒子通过超声再分散至10ml0.1m的磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)中，然后将其放置10小时后，使聚合物粒子完全分散至缓冲溶液中。向该溶液中再加入10ml金色葡萄球菌悬浮液，通过测定混合溶液在600nm出的吸光度值(od600值)记为混合溶液中金色葡萄球菌的初始浓度。利用光照强度为1kw/m²的氙灯照射30min后，再次测定混合溶液的od600值，通过计算即可得到该聚合物粒子的对金色葡萄球菌的杀伤能力为1.2％。