绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用与流程

本发明涉及分子生物学dna标记技术和遗传学应用技术领域，尤其是涉及一种绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用。

背景技术：

微卫星标记(microsatellitemarker)以其长度的多态性而著称，由于其具有稳定性好，多态信息含量丰富，呈共显性遗传，重复性好且易于实现分析自动化等优势，是其他遗传标记所不能替代的，因而被广泛应用于动植物的遗传图谱构建、遗传多样性评价、数量性状定位、亲子鉴定和个体识别等方面。

就微卫星分子遗传标记技术而言，其中最重要的是如何获得标记数量多、遗传多态性高且可以稳定扩增的微卫星位点，这在群体遗传学研究中的应用极为重要。目前绵羊的微卫星位点比较多，但基本上均是为二碱基重复单元的微卫星位点，绵羊的四碱基重复微卫星标记目前还未见报道。相对于二碱基或三碱基重复微卫星位点，四碱基重复微卫星最大的优势是在pcr扩增过程中不容易产生因pcr扩增链滑脱产生的影子带，因而四碱基重复微卫星更容易从电泳峰图上读取等位基因进行统计分析。绵羊微卫星标记在绵羊的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、个体识别、亲子鉴定和标记辅助选择等方面均具有重要的作用，因此开发四碱基重复微卫星标记是十分必要的。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法，该方法能够筛选出具有良好多态性的四碱基重复微卫星标记。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法，包括如下步骤：

(a)在绵羊全基因组中进行blast比对，查找所有染色体上四碱基重复的微卫星标记；

(b)设计用于扩增步骤(a)筛选得到的微卫星标记的引物，所述引物包括正向引物和反向引物；

(c)对步骤(a)筛选得到的微卫星标记进行pcr扩增，筛选出pcr扩增产物条带单一且清晰的微卫星标记；

(d)选取至少20个绵羊样本，对步骤(c)筛选得到的微卫星标记进行三引物pcr扩增，所述三引物pcr扩增包括使用如下引物扩增微卫星标记：5’端融合有正向通用引物的所述正向引物、5’端标记荧光标记的所述正向通用引物和所述反向引物；

(e)通过分析步骤(d)的扩增产物来对微卫星标记进行多态性鉴定，得到所述绵羊四碱基重复微卫星标记。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法从已有的绵羊全基因组序列出发，筛选得到若干候选的微卫星标记，然后通过分析候选位点扩增产物条带的特异性，以及候选位点的多态性，筛选得到四碱基重复的微卫星标记。该方法筛选得到的微卫星标记多态性好，为绵羊的亲子鉴定、种群遗传多样性、性别鉴定等研究奠定基础。并且通过使用三引物pcr避免了给每个正向引物标记荧光标记，降低了分析成本，提高了分析的通量。本发明提供的绵羊四碱基重复微卫星标记与二碱基重复的微卫星标记相比，四碱基重复微卫星标记pcr扩增不易出现影子带，数据的读取方便、准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提取的部分绵羊dna样品琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例微卫星标记pcr扩增的部分琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法，包括如下步骤：

(a)在绵羊全基因组中进行blast比对，查找所有染色体上潜在的四碱基重复微卫星标记，优选核心序列重复单元数目大于或等于7个以上的微卫星标记，统计其染色体的分布情况。为了保证筛选出的微卫星标记在遗传多样性和亲子鉴定方面的应用，需避免单条染色体上微卫星标记过多，两个微卫星标记在染色体上距离太近等问题，优选同一染色体上微卫星标记的数量≤3；同一染色体上任意两个微卫星标记的距离优选至少为200kb。

(b)设计用于扩增步骤(a)筛选得到的微卫星标记的引物，所述引物包括正向引物和反向引物。设计引物使用的工具本发明不作限制，采用本领域常规软件设计工具即可。设计引物时需注意以下几个方面：(1)对微卫星位点四碱基重复序列的两侧序列进行保守性分析，针对每个含有四碱基重复的区域，需将两侧序列进行比对确定引物所在区域在全基因组中为单一序列，即需排除高度重复序列，因为以高度重复序列为靶序列设计引物可能导致大量的pcr非特异性扩增。(2)引物的参数优选如下：引物长度优选为18～30bp；引物gc含量优选为35～60％；引物的退火温度优选为50～65℃；引物的扩增片段长度优选为100～400bp。另外要考虑引物的内部结构，如发夹结构和引物二聚体等。

(c)对步骤(a)筛选得到的微卫星标记进行pcr扩增，扩增后电泳扩增产物，在凝胶成像系统中成像，将没有扩增条带、扩增条带不清晰以及有非特异性扩增条带的位点去除，将扩增条带单一且清晰的微卫星标记保留进行下一步的分析。优选回收pcr扩增条带单一且清晰的微卫星位点的扩增产物，回收后对扩增产物进行测序，得到这些位点的序列信息，并与绵羊基因组比对，确定筛选得到的位点的序列和绵羊基因组的序列一致。

(d)选取至少20个绵羊样本，对每个绵羊样本中步骤(c)筛选得到的微卫星标记进行三引物pcr扩增，三引物pcr扩增使用的三种引物如下：步骤(b)中设计的正向引物，并且在正向引物的5’端融合正向通用引物序列；单独的正向通用引物，并且正向通用引物的5’端使用荧光标记标记；以及步骤(b)中设计的反向引物。需要说明的是，步骤(c)扩增时使用的正向引物5’端可以不融合正向通用引物序列，但是在筛选过程中可以直接合成5’端融合有正向通用引物序列的正向引物，然后步骤(b)的扩增过程中也使用5’端融合有正向通用引物的正向引物，以减少筛选过程中需要合成的引物的数量。三引物pcr扩增的原理如下：pcr过程中5’端融合有正向通用引物的正向引物将正向通用引物序列引物目标dna片段中，使扩增产物的5’端融合有正向通用引物序列；然后5’端标记荧光标记的正向通用引物以5’端融合有正向通用引物序列的dna片段为模板，使扩增产物标记荧光。

所述正向通用引物可选择本领域常规的通用引物，本发明对此不作限制，一些正向通用引物的实例包括m13通用引物，m13通用引物例如可以为但不限于为m13(-47)、m13(-40)或m13(-21)。在一些实施例中使用的正向通用引物包括m13(-21)，m13(-21)的序列如seqidno.97所示(5'-tgtaaaacgacggccagt-3')。

当用于扩增所有微卫星标记的正向通用引物只使用一种颜色的荧光标记标记时，在后续的分析步骤时，每个通道只能分析一个位点。因此在一些优选的实施方式中，为了提高后续分析时的通量，在正向通用引物5’端标记不同的荧光标记，即单独的一条正向通用引物只标记一种颜色的荧光标记，但是用于扩增不同位点的正向通用引物的荧光标记不同。优选使用2～5种不同颜色的荧光标记，在该实施方式中，每个通道可以同时分析2～5个位点，从而提高了筛选效率。优选使用3种不同颜色的荧光标记，例如给正向通用引物分别标记fam、tamra或hex，能够兼顾提高分析通量和保证分析的准确度。

为了后续对各位点的多态性进行分析，因此该步骤中需要扩增多个绵羊样本的位点，绵羊样本量优选为25～35，样本量过多会增加筛选的工作量，过少会降低后续多态性分析的准确度。

三引物pcr扩增时，三引物pcr扩增的反应体系中的5’端融合有正向通用引物的正向引物、5’端标记荧光标记的正向通用引物和所述反向引物的摩尔比优选为(0.8～1.2)：(1.2～2)：2。优选的反应体系实例如下：2×pcrmix7μl，5’端融合有正向通用引物的正向引物0.2μl(12.5μm)，荧光标记通用引物0.2μl(25μm)，反向引物0.2μl(25μm)，用双蒸水补足至总体积15μl。

三引物pcr扩增的扩增程序包括先以所述正向引物的退火温度扩增25～35个循环，再以所述正向通用引物的退火温度扩增5～15个循环。其中正向引物的退火温优选为57～59℃；正向通用引物的退火温度优选为52～54℃。优选的反应程序实例如下：首先模板在95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，循环30次；然后继续94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，循环8次；最后72℃延伸维持10min，扩增产物4℃保存。

(e)分析步骤(d)的扩增产物，对微卫星标记进行多态性鉴定，得到所述绵羊四碱基重复微卫星标记。优选对步骤(d)的扩增产物进行毛细管电泳并采集数据，然后对采集的数据进行荧光颜色分离，利用分型标准物计算等位基因大小，得到各基因组的基因分型数据，然后对绵羊四碱基重复微卫星进行多态性鉴定。其中优选使用abi3730dna测序仪进行毛细管电泳并采集数据；优选使用genemaker软件对采集的数据进行荧光颜色分离；分型标准物优选genescan600分子内标。对绵羊四碱基重复微卫星进行多态性鉴定包括分析微卫星位点的等位基因数、多态信息含量、期望杂合度、观测杂合度和哈迪-温伯格平衡中的一种或多种。多态性鉴定的实例可选地包括分析卫星位点的等位基因数、多态信息含量和期望杂合度；可选地包括分析卫星位点的多态信息含量、期望杂合度、观测杂合度和哈迪-温伯格平衡；可选地包括微卫星位点的等位基因数、多态信息含量、期望杂合度、观测杂合度和哈迪-温伯格平衡检验，以保证筛选得到的位点具有足够的多态性。等位基因数优选至少为5个；多态信息含量优选至少为0.5；观测杂合度优选至少为0.5；期望杂合度优选至少为0.5；哈迪-温伯格平衡的p值优选至少为0.05。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一组绵羊四碱基重复微卫星标记，本发明提供的绵羊四碱基重复微卫星标记主要由采用上述绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法筛选得到的微卫星标记组成，包括ovr1402、ovr1602、ovr2001、ovr0501、ovr2101、ovr0201、ovr0702、ovr0503、ovr1002、ovr2204、ovr0502、ovr1401、ovr2304、ovr1901、ovr2604、ovr2601、ovr1101、ovr1003、ovr1601、ovr2401、ovr2202、ovr0602、ovr2103、ovr1702、ovr1501、ovr2606、ovr1001、ovr1801、ovr2102、ovr0801、ovr0802和ovr0902中的一个或多个微卫星标记，各微卫星标记的信息如下：

ovr1402的微卫星重复基序为(atag)9，ovr1402的核苷酸序列为seqidno.1所示序列，或为与seqidno.1同源性90％以上的序列；ovr1602的微卫星重复基序为(ctat)7，ovr1602的核苷酸序列为seqidno.2所示序列，或为与seqidno.2同源性90％以上的序列；ovr2001的微卫星重复基序为(atag)6，ovr2001的核苷酸序列为seqidno.3所示序列，或为与seqidno.3同源性90％以上的序列；ovr0501的微卫星重复基序为(atag)12，ovr0501的核苷酸序列为seqidno.4所示序列，或为与seqidno.4同源性90％以上的序列；ovr2101的微卫星重复基序为(ctat)5，ovr2101的核苷酸序列为seqidno.5所示序列，或为与seqidno.5同源性90％以上的序列；ovr0201的微卫星重复基序为(ctat)8，ovr0201的核苷酸序列为seqidno.6所示序列，或为与seqidno.6同源性90％以上的序列；ovr0702的微卫星重复基序为(atag)15，ovr0702的核苷酸序列为seqidno.7所示序列，或为与seqidno.7同源性90％以上的序列；ovr0503的微卫星重复基序为(ctat)7，ovr0503的核苷酸序列为seqidno.8所示序列，或为与seqidno.8同源性90％以上的序列；ovr1002的微卫星重复基序为(atag)13，ovr1002的核苷酸序列为seqidno.9所示序列，或为与seqidno.9同源性90％以上的序列；ovr2204的微卫星重复基序为(ctat)9，ovr2204的核苷酸序列为seqidno.10所示序列，或为与seqidno.10同源性90％以上的序列；ovr0502的微卫星重复基序为(atag)7，ovr0502的核苷酸序列为seqidno.11所示序列，或为与seqidno.11同源性90％以上的序列；ovr1401的微卫星重复基序为(ctat)7，ovr1401的核苷酸序列为seqidno.12所示序列，或为与seqidno.12同源性90％以上的序列；ovr2304的微卫星重复基序为(atag)11，ovr2304的核苷酸序列为seqidno.13所示序列，或为与seqidno.13同源性90％以上的序列；ovr1901的微卫星重复基序为(ctat)7，ovr1901的核苷酸序列为seqidno.14所示序列，或为与seqidno.14同源性90％以上的序列；ovr2604的微卫星重复基序为(ctat)10，ovr2604的核苷酸序列为seqidno.15所示序列，或为与seqidno.15同源性90％以上的序列；ovr2601的微卫星重复基序为(ctat)10，ovr2601的核苷酸序列为seqidno.16所示序列，或为与seqidno.16同源性90％以上的序列；ovr1101的微卫星重复基序为(ctat)15，ovr1101的核苷酸序列为seqidno.17所示序列，或为与seqidno.17同源性90％以上的序列；ovr1003的微卫星重复基序为(atag)10，ovr1003的核苷酸序列为seqidno.18所示序列，或为与seqidno.18同源性90％以上的序列；ovr1601的微卫星重复基序为(atag)10，ovr1601的核苷酸序列为seqidno.19所示序列，或为与seqidno.19同源性90％以上的序列；ovr2401的微卫星重复基序为(atag)11，ovr2401的核苷酸序列为seqidno.20所示序列，或为与seqidno.20同源性90％以上的序列；ovr2202的微卫星重复基序为(atag)12，ovr2202的核苷酸序列为seqidno.21所示序列，或为与seqidno.21同源性90％以上的序列；ovr0602的微卫星重复基序为(atag)14，ovr0602的核苷酸序列为seqidno.22所示序列，或为与seqidno.22同源性90％以上的序列；ovr2103的微卫星重复基序为(ctat)6，ovr2103的核苷酸序列为seqidno.23所示序列，或为与seqidno.23同源性90％以上的序列；ovr1702的微卫星重复基序为(ctat)12，ovr1702的核苷酸序列为seqidno.24所示序列，或为与seqidno.24同源性90％以上的序列；ovr1501的微卫星重复基序为(ctat)13，ovr1501的核苷酸序列为seqidno.25所示序列，或为与seqidno.25同源性90％以上的序列；ovr2606的微卫星重复基序为(atag)6，ovr2606的核苷酸序列为seqidno.26所示序列，或为与seqidno.26同源性90％以上的序列；ovr1001的微卫星重复基序为(atag)11，ovr1001的核苷酸序列为seqidno.27所示序列，或为与seqidno.27同源性90％以上的序列；ovr1801的微卫星重复基序为(ctat)13，ovr1801的核苷酸序列为seqidno.28所示序列，或为与seqidno.28同源性90％以上的序列；ovr2102的微卫星重复基序为(atag)10，ovr2102的核苷酸序列为seqidno.29所示序列，或为与seqidno.29同源性90％以上的序列；ovr0801的微卫星重复基序为(atag)15，ovr0801的核苷酸序列为seqidno.30所示序列，或为与seqidno.30同源性90％以上的序列；ovr0802的微卫星重复基序为(atag)13，ovr0802的核苷酸序列为seqidno.31所示序列，或为与seqidno.31同源性90％以上的序列；ovr0902的微卫星重复基序为(atag)8，ovr0902的核苷酸序列为seqidno.32所示序列，或为与seqidno.32同源性90％以上的序列。

其中“同源性”指的是核苷酸序列与目标序列的相似性。和目标所示序列90％以上同源性的序列和目标序列的差异包括但不限于由一个或者几个核苷酸的缺失、突变、减少或增加导致，比如微卫星位点的侧翼序列增加或减少一个或几个核苷酸，这些改变使核苷酸序列与目标序列的核苷酸序虽然有差异，但是具有90％以上，例如可以为但不限于为90％、92％、95％、98％或99％的相似度，同时具有相同的重复基序。核苷酸序列和目标序列的同源性可以通过本领域常规软件实现，本发明对此不做限制。

本发明提供的一组绵羊四碱基重复微卫星标记至少包括ovr1402、ovr1602、ovr2001、ovr0501、ovr2101、ovr0201、ovr0702、ovr0503、ovr1002、ovr2204、ovr0502、ovr1401、ovr2304、ovr1901、ovr2604、ovr2601、ovr1101、ovr1003、ovr1601、ovr2401、ovr2202、ovr0602、ovr2103、ovr1702、ovr1501、ovr2606、ovr1001、ovr1801、ovr2102、ovr0801、ovr0802和ovr0902中的一个；也可以多个微卫星标记联用，以提高检测的准确度，例如将20个微卫星位点ovr1402、ovr1602、ovr0501、ovr0201、ovr0702、ovr1002、ovr2204、ovr0502、ovr2304、ovr1901、ovr2601、ovr1101、ovr1003、ovr2401、ovr1702、ovr1501、ovr1801、ovr2102、ovr0801和ovr0802联用等。优选至少包含十三个绵羊四碱基重复微卫星标记ovr1402、ovr1602、ovr0501、ovr0201、ovr0702、ovr1002、ovr2204、ovr0502、ovr2401、ovr1702、ovr1501、ovr1801和ovr2102，作为亲子鉴定检测效果更佳。

根据本发明提供的另一个方面，本发明还提供了用于扩增上述绵羊四碱基重复微卫星标记的引物组，根据具体的待扩增的微卫星标记，该引物组可选取如下引物对中的一对或多对。

用于扩增ovr1402的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.33所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.34所示；用于扩增ovr1602的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.35所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.36所示；用于扩增ovr2001的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.37所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.38所示；用于扩增ovr0501的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.39所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.40所示；用于扩增ovr2101的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.41所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.42所示；用于扩增ovr0201的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.43所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.44所示；用于扩增ovr0702的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.45所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.46所示；用于扩增ovr0503的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.47所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.48所示；用于扩增ovr1002的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.49所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.50所示；用于扩增ovr2204的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.51所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.52所示；用于扩增ovr0502的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.53所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.54所示；用于扩增ovr1401的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.55所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.56所示；用于扩增ovr2304的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.57所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.58所示；用于扩增ovr1901的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.59所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.60所示；用于扩增ovr2604的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.61所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.62所示；用于扩增ovr2601的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.63所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.64所示；用于扩增ovr1101的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.65所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.66所示；用于扩增ovr1003的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.67所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.68所示；用于扩增ovr1601的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.69所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.70所示；用于扩增ovr2401的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.71所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.72所示；用于扩增ovr2202的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.73所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.74所示；用于扩增ovr0602的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.75所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.76所示；用于扩增ovr2103的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.77所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.78所示；用于扩增ovr1702的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.79所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.80所示；用于扩增ovr1501的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.81所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.82所示；用于扩增ovr2606的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.83所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.84所示；用于扩增ovr1001的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.85所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.86所示；用于扩增ovr1801的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.87所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.88所示；用于扩增ovr2102的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.89所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.90所示；用于扩增ovr0801的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.91所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.92所示；用于扩增ovr0802的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.93所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.94所示；用于扩增ovr0902的引物对：正向引物的核苷酸序列如seqidno.95所示；反向引物的核苷酸序列如seqidno.96所示。

在一些优选的实施方式中，所述引物组中的引物对被标记物标记。所述引物对带有标记指的是引物对中的正向引物和反向引物中至少一个带有标记即可，也可以正向引物和反向引物同时带有标记。使用标记物标记引物对的目的是使扩增产物带有标记，方便后续检测，具体的标记物可选择本领域常规的标记物，本发明对此不作限制。可以理解的是当引物组中含有多个引物对时，不同引物对标记的标记物可以相同也可以不相同。优选使用方便检测的荧光标记标记引物对。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了包含上述引物组的试剂盒。该试剂盒可以用于扩增上述绵羊四碱基重复微卫星标记。该试剂盒还可以包括用于pcr反映的缓冲液，包括但不限于pcr缓冲液、dntp、盐和dna聚合酶等反应试剂，还可以包含常规的实验耗材等。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述绵羊四碱基重复微卫星标记的筛选方法、上述绵羊四碱基重复微卫星标记、上述引物组或上述试剂盒在绵羊的亲子鉴定中的应用。本发明提供的筛选方法以及筛选得到的四碱基重复微卫星多态性好，且扩增得到的条带不易出现影子带，数据的读取方便、准确，适合作为遗传分子标记应用于绵羊的亲子鉴定中。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例

1材料和方法

1.1实验材料：本发明中的dna样品来自吉林省乾羊农牧业有限责任公司，共采集40只小尾寒羊血液样品。

1.2实验主要试剂和仪器

1.2.1主要实验试剂：dna提取试剂盒(北京天根生物科技公司)；50×tae缓冲液配制：称量tris242g，na2edta·2h2o37.2g于1l烧杯中，加入800ml去离子水，充分搅拌均匀后，加入57.1ml冰醋酸充分溶解，加去离子水定容至1l，室温保存(需使用琼脂糖凝胶电泳时，稀释少量至1×tae备用)。

1.2.2主要实验仪器：移液器，台式高速离心机，pcr扩增仪，凝胶成像系统，电泳仪，4℃冰箱，高压灭菌锅，电热鼓风干燥箱，电子天平，微波炉，琼脂糖水平电泳槽，旋涡振荡器。

1.3实验方法

1.3.1血液dna的提取：小尾寒羊血液dna的提取采用北京天根生物科技公司的血液dna提取试剂盒提取，-20℃保存。

1.3.2四碱基微卫星序列的筛选：在绵羊全基因组中进行blast比对，查找绵羊基因组中存在的四碱基重复序列染色体区域，获得核心序列重复单元数目大于或等于7个以上，同时两端序列为非特异性重复序列的位点，统计其染色体的分布情况。

1.3.3微卫星引物设计：在微卫星四碱基重复序列侧翼，使用软件primer5.0设计引物，设计引物时需注意以下几点：微卫星位点四碱基重复序列两侧序列的保守性分析，针对每个含有四碱基重复的区域，需将两侧序列进行比对确定引物所在区域在全基因组中为单一序列，即需排除高度重复序列，因为以高度重复序列为靶序列设计引物可能导致大量的pcr非特异性扩增。

设计引物长度为18～30bp，gc含量35～60％，退火温度为50～65℃，扩增片段的长度为100～400bp。其中每个位点正向引物的5′末端均增加了m13(-21)通用引物序列。另外，单独合成了5'端添加荧光标记的m13(-21)通用引物，荧光标记分别为fam、tamra或hex等3种。

为了保证本实施例开发的微卫星标记在遗传多样性和亲子鉴定方面的应用，需避免单条染色体上微卫星位点过多，两个微卫星位点在染色体上距离太近等问题。另外要考虑引物的内部结构，如发夹结构和引物二聚体等。

1.3.4目的片段的pcr扩增：随机选择2个样品进行pcr扩增，反应体系为：2×pcrmix10μl，正向引物和反向引物各0.2μl(25μm)，用双蒸水补足到20μl。扩增程序为：首先95℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度58℃30s；72℃延伸30s，循环30次；再72℃终延伸5min，pcr扩增产物4℃保存。

1.3.5微卫星标记引物的pcr扩增特异性鉴定：pcr产物经2.5％的琼脂糖凝胶电泳分离分析，在凝胶成像系统中成像，将没有扩增条带、扩增条带不清晰以及有非特异性扩增条带的位点去除。回收pcr扩增条带单一且清晰的微卫星位点的扩增产物，将回收产物与pmd18-t质粒连接，转化dh5α大肠杆菌，pcr扩增鉴定插入片段大小，将阳性克隆测序，获得了32个具有扩增特异性的微卫星位点。

1.3.6荧光标记微卫星引物的扩增及检测：将筛选出的具有pcr扩增特异性的微卫星位点，对30个绵羊样本进行pcr扩增。反应体系为：2×pcrmix7μl，正向引物0.2μl(12.5μm)，m13(-21)荧光标记通用引物0.2μl(25μm)，反向引物0.2μl(25μm)，用双蒸水补足至总体积15μl。扩增程序为：首先模板在95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，循环30次；然后继续94℃变性30s，53℃复性45s，72℃延伸45s，循环8次；最后72℃延伸维持10min，扩增产物4℃保存。对pcr产物进行abi3730dna测序仪毛细管电泳，分离后的荧光标记pcr扩增dna片段由设备自动检测并储存数据。

1.3.7数据统计分析：使用genemaker软件对采集的数据进行荧光颜色分离，与分型标准物genescan600分子内标计算等位基因大小，进而确定各基因座的基因分型数据。使用cervus3.0软件分析每个位点的等位基因数(n)，多态信息含量(pic)，期望杂合度(he)和观测杂合度(ho)等。使用genpop3.4软件进行各微卫星位点的哈迪-温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，hwe)检验。

1.3.8微卫星标记在亲子鉴定中的应用：应用上述微卫星标记对2个家系中2个子代(s1和s2)、2个母本(m1和m2)以及2只公羊(p1和p2)6个个体进行基因分型，通过cervus3.0软件进行亲子关系鉴定，并将亲子鉴定结果与饲养场系谱进行比对，以验证其准确性。

2结果

2.1绵羊基因组dna提取：采集的绵羊血液提取dna后，使用琼脂糖凝胶电泳法，经凝胶成像系统观察结果。本实施例检测40个绵羊样品dna质量及完整性，如图1所示，图1中泳道m为dl15000dnamarker，泳道1～24为绵羊个体编号。结果表明绵羊样品dna质量较好，可进行下一步实验。

2.2引物设计与扩增鉴定：通过四碱基微卫星标记的全基因组筛选，引物设计，pcr扩增和克隆，以及序列分析，本实施例共筛选出能特异性扩增的微卫星标记引物共32对，如表1所示。部分微卫星标记pcr扩增琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，其中泳道m为dl15000dnamarker，泳道1～16的微卫星标记依次为ovr1402、ovr1602、ovr2001、ovr0501、ovr2101、ovr0201、ovr0702、ovr0503、ovr1002、ovr2204、ovr0502、ovr1401、ovr2304、ovr1901、ovr2604和ovr2601。

表132对绵羊四碱基重复单元微卫星标记引物特征

2.3微卫星标记的遗传多样性分析

筛选出的绵羊四碱基重复微卫星标记遗传信息参数分析结果如表2所示，32个微卫星标记的等位基因数均大于5，等位基因数在5～15个之间，32个标记共扩增出272个等位基因，平均等位基因数为8.500；多态信息含量(pic)在0.566～0.898之间，观测杂合度(ho)范围在0.548～0.903之间，期望杂合度(he)范围在0.631～0.921之间，平均期望杂合度为0.7799；哈代-温伯格平衡检验结果表明32个位点均处于遗传平衡状态。综上所述，32个微卫星标记均表现为高度多态性，可应用于绵羊亲缘关系鉴定分析和遗传多样性分析。

表232个微卫星标记的多态信息参数分析

注：k为等位基因数，n为基因分型个体数，ho为观测杂合度，he为期望杂合度，pic为多态信息含量。

2.4亲子鉴定结果

cervus软件鉴定结果表明子代s1与m2、子代s2与m1为母子关系，子代s1和s2与公羊p1为父子关系，而与公羊p2无亲缘关系，均与系谱中亲生母本和父本相匹配。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>吉林省农业科学院

<120>绵羊四碱基重复微卫星标记及其筛选方法、引物组和应用

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aatgcctctacctggagtgatgc23

<210>42

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

gagccattggggaagctaagg21

<210>43

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

gcagcctaagcgtgaatgtgaa22

<210>44

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

ttggcaagaaatcaatctggtc22

<210>45

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

caatactttgtttttgaggctgg23

<210>46

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

gttgaaaacaggtatcccttggtat25

<210>47

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

tggttgaacagcctgtggatt21

<210>48

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

acccagtccttggcaatgttac22

<210>49

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

aatcaggtgttgttgtttcagg22

<210>50

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

gctatgatcaatctaagctgataattg27

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

aatcacccttctcacattcacc22

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

tcctccaacctccttccaaact22

<210>53

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

ttctgttacatgctagaggcca22

<210>54

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

ttacattttgctccctgtccct22

<210>55

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

tcaatcaaagtctgtaatggaatcac26

<210>56

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

aaagactgtccttgccaaatca22

<210>57

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

cataactgttttactacctggaccact27

<210>58

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

gtttcaagtatacagcacaatgagtct27

<210>59

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

tgccagttcctcagacaccatc22

<210>60

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

tagaatcctgcccactattgtcct24

<210>61

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

gccagagagacctattgggagc22

<210>62

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

tgactaagccaaaatacccagc22

<210>63

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

tattcctgaataaactcatctttact26

<210>64

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

ttccgttttgagtgaaatgtcc22

<210>65

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

ctctacaaaatgttccgccaagt23

<210>66

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

tccaggaaagtcccaggtgtc21

<210>67

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

ccccaggaagagagggtatcac22

<210>68

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

cctaatacacttgcttttgaatgc24

<210>69

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>69

ccagctgagctaccagtatataaaac26

<210>70

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>70

ctttcaagtctcattgtaaaccatt25

<210>71

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>71

cacagtcagagctgggagttagag24

<210>72

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>72

ccctgtcttctggttcactcatc23

<210>73

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>73

ggacacaactgagtgactaagc22

<210>74

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>74

tggtgccagcaaggaaatcc20

<210>75

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>75

ccaggggaggcattttcaac20

<210>76

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

aaactcactccaaggcaagtaaca24

<210>77

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>77

gtttctgtcaagtgtgtgatgctg24

<210>78

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>78

ttatgttccttttgcggatgtca23

<210>79

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

actttttgatttgcccaggttc22

<210>80

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>80

tgctttccctgtgtccaactga22

<210>81

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

tgatttagaaaaagtggttggagtc25

<210>82

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>82

ggttttagacttcctccacacacaa25

<210>83

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

agacccagtgtatgtcagccttc23

<210>84

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>84

cgtcatccctgtcttctttcctct24

<210>85

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>85

ctccccaaaatcaagagggttag23

<210>86

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

tgttatcatttccctgtgcttca23

<210>87

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

ctggagttattatgtgactgtgtgg25

<210>88

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

tccttagagccaattacacgaact24

<210>89

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

ccctggcacccaatctaaagta22

<210>90

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

gccttcttcattttggagggtta23

<210>91

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

ctctttttgagacaagccacct22

<210>92

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

tcccaagacacagaaagaacag22

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>93

gcttctgtcagtagtggcatctt23

<210>94

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

cgtcttcccctccaaaagttagt23

<210>95

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>95

ccagtaaaatccaggacattctcat25

<210>96

<211>25

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<213>人工序列

<400>96

aatgttgactaccaagtgctttacg25

<210>97

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>97

tgtaaaacgacggccagt18