本发明涉及一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，尤其是一种利用现代生物酶解技术和高效分离提取技术制备高提取率高纯度软骨素产品的新工艺，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：近年来，由于渔业资源日趋匮乏及各国陆续实行禁捕限捕政策，鱼粉产量迅速下降。在我国，由于鱼粉进口量逐年降低，已难以满足养殖需求。在此背景下，肉粉作为鱼粉的替代品在国内迅速崛起，已经成为饲料工业的重要组成部分，产能急剧提升。与此同时，肉粉加工产生了大量的废弃动物骨浆，从动物骨浆中可以提取出高端产品：肉粉、高纯度蛋白、软骨素；其中软骨素为从动物软骨中提取的黏多糖类物质，具有抗炎、抗癌、降血脂、抗凝血活性、预防关节炎、改善食物风味、色泽和保湿型等功能活性，在防治心血管疾病、关节病等方面具有重要作用。但是目前肉骨粉加工副产物高浓度废浆资源化再利用程度低，环境污染隐患较大、无害化治理成本较高，成为制约肉骨粉产业发展和提质增效的最关键瓶颈因素。对肉骨粉加工废液进行软骨素的提取利用对提升肉粉加工产业经济效益具有显著的带动提升作用。软骨素是广泛存在于动物结缔组织中的糖胺聚糖，具有缓解关节炎、降血脂、抗氧化、抗血管生成等多种生理功能，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域，具有广阔的开发前景。当前软骨素原料以动物软器官为主，如牛、鸡鸭等的器官，原料成本高，出成率在12-15%之间，导致软骨素成本昂贵，市场上供不应求。利用肉骨粉废浆提取软骨素不仅可以实现废浆的高值化再利用，而且对于促进软骨素在食品及医养健康领域中的应用。目前，软骨素的提取方法主要有稀碱、稀碱盐、稀碱酶等，产存在品得率低，蛋白质和氮杂质含量较高等别丢按。采用酶解法提取软骨素，蛋白酶可以特异性将蛋白质水解，与软骨素结合的蛋白质就分解为小分子的氨基酸，然后跟据氨基酸与软骨素在某些溶剂中溶解性的不同，从而使软骨素与其它杂质分离，可明显提高软骨素的得率。采用复合酶解法提取，可以避免稀碱-酶解提取方法和浓碱-酶解提取方法在生产过程中酸碱对环境的污染，同时避免了酸碱对软骨素产品功能活性的影响。技术实现要素：为了克服上述现有技术的不足，实现肉粉加工废浆的功能活性物质高效提取，本申请提供一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，集成现代生物酶解技术和高效分离提取技术，从肉骨粉废浆中提取出高纯度、高活性的软骨素产品，满足保健、医疗、食品等领域对软骨素的应用需求，该工艺制备的软骨素产品得率高，产品具有较高的抗炎、抗癌、降血脂、抗凝血活性、预防关节炎、改善食物风味、色泽和保湿型功效，可广泛应用于各个领域，尤其是在医养健康领域，具有显著的保健功效和应用价值；同时，分离出肉粉和高纯度蛋白粉产品，进一步提升了该工艺的资源循环利用率和经济效益。本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比1～2%的胰酶粉、2～3%的蛋白酶、1～2%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解6～12h；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。优选的，复合酶解过程中胰酶粉、蛋白酶和猪胰脏粉的添加量分别为动物骨浆质量比的2%、2.5%和1.3%。优选的，上述蛋白酶可以是胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的一种或几种的混合物。最优的，上述蛋白酶是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合物，其质量比为3:2。优选的，上述步骤（3）过滤后的肉粉和油脂可回用于肉骨粉生产，提高肉骨粉的产率。优选的，上述步骤（4）中树脂吸附后的溶液可进行纳滤、双效蒸发和喷雾干燥制备蛋白粉。优选的，上述步骤（5）中超滤采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、卷式超滤膜或平板式超滤膜。本发明提供一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，所得软骨素呈白色粉末状，chs含量>95%，氮含量＜2%，并具有较高的抗炎、抗癌、降血脂、抗凝血活性、预防关节炎、改善食物风味、色泽和保湿型功效，可广泛应用于各个领域，尤其是在医养健康领域，具有显著的保健功效和应用价值。本发明提供一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：（1）本发明利用动物骨浆为原料，通过生物酶解技术实现肉骨粉加工废弃物动物骨浆的高值化利用和无害化治理，不仅可以提取高纯度的软骨素产品，而且可以联产肉粉和蛋白粉；（2）本申请利用酶解法提取软骨素，蛋白酶可以特异性将蛋白质水解，与软骨素结合的蛋白质就分解为小分子的氨基酸，然后跟据氨基酸与软骨素在某些溶剂中溶解性的不同，从而使软骨素与其它杂质分离，酶解提取法可明显提高软骨素的得率和营养价值；本发明试验结果表明复合酶制剂中蛋白酶系的组成对硫酸软骨素的营养特性影响显著；（3）本发明采用复合酶解法提取，在避免生产过程中酸碱环境污染的同时，避免了酸碱对软骨素产品功能活性的影响，经过树脂精制后的软骨素产品在质量、性能和功能上显著优于市场同类产品，具有广阔的市场应用价值；（4）本发明实现软骨素等高附加值产品的产业化，实现了无害化废弃物资源全利用，为开发软骨素的提取资源、实现副产物的高值化利用及提高肉骨粉加工程度提供了一条行之有效的途径，有效解决了肉粉加工环境污染问题，变废为宝，产生良好的经济、社会及生态环境效益。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。实施例1一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合物，其质量比为3:2；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例2一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶是木瓜蛋白酶；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例3一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶为胃蛋白酶；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例4一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的混合物，其质量比为2:3；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例5一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶为胰蛋白酶；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例6一种生物法利用肉骨粉废浆提取软骨素的工艺，具体包括如下步骤：（1）原料准备：将油浆分离后的动物骨浆打入酶解罐，备用；（2）复合酶解：向动物骨浆中加入原料质量比2%的胰酶粉、2.5%的蛋白酶、1.3%的猪胰脏粉，在40～60℃的条件下酶解9h；所述蛋白酶为风味蛋白酶；（3）过滤：酶解结束后对酶解液进行过滤，除去肉粉和油脂；（4）树脂吸附：将滤液通过离子吸附树脂柱吸附，完毕后用0.5mol/l的nacl溶液洗涤，再用1.8mol/l的氯化钠溶液洗脱，流速2l/h，得到软骨素原液；（5）加水超滤：向软骨素原液中加入等体积的纯净水，然后进行超滤，除去不溶性杂质；（6）沉淀：调节滤液ph至6.8～7.2，再加入1.5倍体积的95%以上乙醇，充分搅拌后静置12小时以上，虹吸上层乙醇，即得硫酸软骨素；（7）纯化：将软骨素溶于浓度为2～5%的氯化钠溶液中，加入少量乙醇，于低温下静置后离心，将其上清液中再加入少量乙醇，重复以上步骤，可依次得到高纯度的硫酸软骨素；（8）脱水烘干：用95%以上的丙酮对产品进行脱水，再真空干燥即得软骨素产品。实施例71、指标测定方法根据谢果凰《鲨鱼硫酸软骨素的分离提纯及其抗氧化功能的研究》所述方法测定硫酸软骨素提取率；根据张秀娟等《鲨鱼软骨粉对s180荷瘤小鼠免疫细胞调节功能的影响》文中所述试验方法测定本申请软骨素对对s180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖功能和吞噬细胞吞噬活性的影响。2、试验方法及分组小鼠随机分成8组,试验组软骨素灌胃给予100mg·kg-1，阴性对照组给予同体积生理盐水,每组10只。无菌抽取接种第7天的生长良好的s180荷瘤小鼠腹水(活细胞数>97%),生理盐水1∶3稀释,按0.2ml/只,小鼠右前腋皮下接种。接种24h后给药,1次/d,连续给药10d,停药次日眼球采血；分组方法为：实施例1-6组分别灌胃实施例1-6所述软骨素，阳性对照组灌胃酶解过程中不添加蛋白酶的软骨素，其余同实施例1；空白对照组灌胃等体积的蒸馏水；试验方法均相同；3、试验结果表1不同工艺条件软骨素提取率及免疫增强抗肿瘤能力的影响试验组别提取率（%）a570值a490值空白对照组—0.22570.5649实施例1试验组10.210.58461.1879实施例2试验组9.270.48930.9056实施例3试验组8.740.45870.9452实施例4试验组8.290.46230.9731实施例5试验组6.290.48930.9905实施例6试验组8.510.40290.9121阳性对照组6.320.41270.7893上述实验结果表明本发明实施例均具有较好的软骨素提取率，且所得软骨素均具有较好的抗肿瘤免疫增强活性，营养价值较高，可广泛应用于食品、医疗、保健等领域。此外，实验结果还表明复合酶解过程中蛋白酶的组成对产品的提取率及免疫增强活性具有显著的影响，其中蛋白酶组成为木瓜蛋白酶：胃蛋白酶添加比例为3:2时效果最佳，实施例1为本发明最佳实施例。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页1 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