一种抗Engrailed-2蛋白单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明公开了一种单克隆抗体，属于多肽技术领域。

背景技术：

engrailed-2蛋白是由en2基因编码的一段含有331个氨基酸的同源盒蛋白，其生物学功能是作为转录因子与特定的dna结合，从而在转录水平上起调节作用。绝大部分en-2蛋白作为转录因子定位于核内，但是也发现有一少部分(<5％)en-2蛋白位于胞质内，能被细胞分泌和摄取，并参与调节转录和翻译。

engrailed-2基因属于同源盒基因家族，其在进化中高度保守，主要在转录水平起调控作用。研究发现，en2基因在多种人类肿瘤中异常表达，在细胞的分化、增殖、凋亡中均发挥重要作用。近年来的研究发现，en2基因的异常表达与恶性肿瘤密切相关。

2018年，美国癌症协会公布了一份全世界癌症发生与死亡率的报告，报告指出全球癌症发生率前三的分别是肺癌、乳腺癌、和前列腺癌。在男性中，肺癌和前列腺癌是死亡率最高的两种癌症类型。此外，前列腺癌在全球105个国家都是发生率最高的类型，包括北美、南美、西欧和非洲大部分地区，可以算得上是席卷半个世界的癌症类型了。为此，研制出一种针对前列腺癌的诊断和治疗手段已经刻不容缓。

近年来，随着人口老龄化的发展和饮食结构改变等因素的变化，前列腺癌在中国的发病率也呈逐年上升趋势，已成为最常见的泌尿系肿瘤。我国前列腺癌患者的特点为发现就诊时大多已处于疾病中后期。故而对前列腺癌患者进行早期筛查，能够大幅提高疾病检出率，提高患者的生存期。而前列腺癌目前的标准检测试验psa对前列腺癌诊断的敏感性仅为24％，而通过与血液或者尿液中engrailed-2蛋白含量结合检查，可大幅提高前列腺癌的诊断敏感性，且能减少非必要的早期侵入性检查。

本发明的目的就是提供一种针对en-2蛋白的特异性强、纯度高的单克隆抗体，并将其用于非诊断目的的人en-2蛋白的早期检测。

技术实现要素：

基于上述目的，本发明首先提供了一种抗engrailed-2蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.1的第26-33位、49-55位、88-96位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.3的第26-35位、50-65位、99-111位氨基酸序列所示，或者

所述单克隆抗体轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.5的第24-34位、50-56位、92-98位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.7的第26-35位、50-66位、99-111位氨基酸序列所示。

在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno.3所示，本发明中一个优选的单克隆抗体被命名为5b7，或者

所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7所示，在本发明中一个优选的的单克隆抗体被命名为37c3。

在一个更为优选的实施方案中，所述单克隆抗体轻链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.9所示，所述单克隆抗体重链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.11所示。

第二，本发明还提供了一种编码上述的单克隆抗体的多核苷酸，编码所述单克隆抗体轻链可变区的多核苷酸的序列如seqidno.2所示，编码所述单克隆抗体重链可变区的多核苷酸的序列如seqidno.4所示，或者

编码所述单克隆抗体轻链可变区的多核苷酸的序列如seqidno.6所示，编码所述单克隆抗体重链可变区的多核苷酸的序列如seqidno.8所示。

在一个优选的实施方案中，编码所述单克隆抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno.10所示，编码所述单克隆抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno.12所示。

最后，本发明提供了上述任一单克隆抗体在制备非诊断目的的人前列腺癌检测试剂中的应用。

在一个优选的实施方案中，所述应用为免疫组化检测方法。

在另一个优选的实施方案中，所述应用为胶体金检测方法。

更为优选地，作为标记抗体使用的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，重链可变区的氨基酸序列如seqidno.3所示，作为捕获抗体使用的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7所示。

尤为优选地，所述单克隆抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno.9所示，所述单克隆抗体重链恒定区的氨基酸序列如seqidno.11所示。

本发明通过人工构建engrailed-2基因，并将其导入原核细胞——大肠杆菌中，表达engrailed-2蛋白，并将其纯化。后使用该蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体，最终筛选出5b7、37c3这2株杂交瘤细胞，并得到这2株杂交瘤细胞对应的单克隆抗体。这些抗体可以与engrailed-2蛋白特异性结合，且能与前列腺癌癌患者尿液中的engrailed-2蛋白特异性结合。这些抗体在人前列腺癌的特异性诊断中具有重要的应用价值。因此本发明还提供了这些抗体在制备诊断人前列腺癌检测试剂中的应用。所述的单克隆抗体能够降低免疫反应的交叉反应性，适用于人前列腺癌的早期筛查和诊断。

附图说明

图1.en2c端114aa蛋白sds-page鉴定图谱；

图2.en2c端114aa蛋白的wb鉴定图谱；

图3.293t转染en2-rfp融合蛋白后sds-page鉴定图谱；

图4.western-blotting检测293t转染en2-rfp融合蛋白图谱；

图5.三种前列腺癌细胞系(lncap，du145，pc3)总蛋白的en2单抗检测结果图；

图6.en2单抗的免疫荧光检测图；

图7.外源性和内源性en2蛋白在三种前列腺癌细胞系的亚细胞定位图；

图8.前列腺增生和癌症的代表性的en2免疫组化图；

图9.胶体金法检测前列腺癌病人尿液中en2的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制，本发明的保护范围以权利要求书为准。。

通过ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)查得engrailedhomeobox2基因(nm_001427.3)，选择c末端114aa片段用来制备en2单克隆抗体。通过dna自动合成仪合成该段基因。在获得这些靶序列之后,将其连接于基因表达载体pet-28a的nhei与xhoi之间，并将其转化到大肠杆菌中。在适当的条件下诱导大肠杆菌表达目的片段，经过蛋白的回收和纯化，就获得了重组的engrailed-2蛋白。

在获得高纯度的engrailed-2目的蛋白之后，采用本领域技术人员熟练掌握的单克隆抗体制备技术，即杂交瘤技术，可以获得engrailed-2的单克隆抗体。具体而言，先用纯化的目的蛋白免疫小鼠，分离其脾细胞。使用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。之后筛选出能够产生与目的蛋白发生特异性免疫反应的抗体的杂交瘤细胞，阳性结果意味着该杂交瘤细胞可以合成和分泌特异性的抗engrailed-2蛋白的抗体。从中筛选出阳性克隆后，将该杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔，饲养一段时间后，取小鼠腹水，纯化后即能得到大量针对engrailed-2蛋白的单克隆抗体。

应用en2单克隆抗体进行293t细胞以及三种前列腺癌细胞系(lncap，du145，pc3)的免疫荧光。不仅能染外源转染的en2-rfp红色荧光融合蛋白，也能染内源性en2蛋白。外源转染的en2定位在细胞核内，而内源性en2蛋白呈均匀的细胞浆分布。

应用en2单克隆抗体进行了前列腺癌组织免疫组化染色。en2抗体能够很好反映前列腺癌组织中en2的表达量和亚细胞分布情况，可以帮助临床医生判断病情。

本发明还应用所获得的单克隆抗体对前列腺癌患者尿液进行检测，结果显示这些单克隆抗体可以提供对尿液中engrailed-2蛋白的特异性检测。

本发明提供的单克隆抗体对engrailed-2蛋白具有高度的特异性。因此，在人前列腺癌的特异性诊断上具有重要意义。本发明提供的单克隆抗体可以应用于制备人前列腺癌诊断试剂盒，可以采取本领域常规的技术,例如酶联免疫吸附技术、免疫荧光、免疫组化、胶体金技术等。

在本文上述公开内容的基础上，以下结合具体实施方案和实施例对本发明进行更为详尽的介绍。

实施例1

通过dna自动合成仪合成重组engrailed-2基因及重组engrailed-2蛋白的表达、纯化、鉴定的具体程序。

本研究采用大肠杆菌表达系统表达engrailed-2蛋白。该系统表达的engrailed-2蛋白具有天然构象有活性。其主要流程如下。

1.1dna自动合成仪合成重组engrailed-2基因片段

通过ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)查得engrailedhomeobox2基因，通过dna自动合成仪合成en2基因c末端114aa序列(nm_001427.3)。

1.2重组质粒载体的构建

使用预先选定的nhei与xhoi限制性内切酶，将目的基因序列插入到载体pet-28a的nhei与xhoi之间。

1.3重组质粒转染到大肠杆菌中

1.3.1从-80℃中去除感受态大肠杆菌后直接放置在冰上，加入2ul重组质粒到感受态大肠杆菌(bl21(de3))中，冰上孵育30分钟；

1.3.242℃热击1分钟；

1.3.3冰上孵育；

1.3.4加入1ml无抗生素的培养基，37℃，250转摇床摇1小时。

1.4转染大肠杆菌的筛选

1.4.1将大肠杆菌涂板到含有卡那霉素的固体培养基表面，37℃，过夜孵育；

1.4.2挑选长有菌落的大肠杆菌，进行少量摇菌，破碎，分别使用上清和包涵体跑sds-page胶；

1.4.3挑选出其中成功导入重组质粒的大肠杆菌进行大量培养。

1.5engrailed-2蛋白的表达、纯化和鉴定

1.5.1阳性单克隆大肠杆菌在37℃，250转，摇床3小时；

1.5.2加入1mm诱导剂iptg(异丙基硫代半乳糖苷)，37℃，250转，摇床4小时；

1.5.3收集菌液，12000转，4℃，离心3分钟；

1.5.4弃去上清，用20mmtris-hclph8.0洗两遍；

1.5.5加入15ml20mmtris-hclph8.0，充分重悬大肠杆菌；

1.5.6使用超声波细胞粉碎机，设置条件为超声5s，间隙10s，功率70％，裂解40分钟，进行大肠杆菌裂解；

1.5.7大肠杆菌破碎后，12000rpm，4℃，离心20分钟；

1.5.8取上清，使用ni+亲和层析柱纯化；

1.5.9将纯化后的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，图1为engrailed-2蛋白的sds-page电泳图，在20kd位置的目的条带为engrailed-2蛋白；

1.5.10图2所示为纯化后的engrailed-2蛋白的western-blotting鉴定图。抗体为商品化anti-his单抗和商品化的anti-engrailed-2多抗。在20kd位置的目的条带为engrailed-2蛋白，该图证明本发明的重组engrailed-2蛋白具有天然engrailed-2蛋白的构象；

经过鉴定,显示本发明表达的蛋白分子量为20kd,使用抗-his单抗和抗-engrailed-2多抗均能在20kd显示出特异性条带。

实施例2：单克隆抗体的制备

2.1免疫动物:

选用清洁级6-8周龄的雌性balb/c小鼠(从中国医学科学院动物所购得)作为免疫对象。按照《当代免疫学技术与应用》(主编巴德年)(北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998年)书中的单抗制备方法进行。

具体如下：

初次免疫ag1～50ug/0.8～1.0m1加福氏完全佐剂

皮下多点注射(0.2ml/点)

↓3周后

第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂

皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)

↓3周后

第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip(5～7天后采血测其效价,检测免疫效果)

↓2～3周后

加强免疫,剂量50～500ug为宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合

2.2.细胞融合:

2.2.1取对数生长的骨髓瘤细胞sp2/0(购于中国协和医科大学细胞中心)，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计，,取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次；

2.2.2同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次；

2.2.3将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内，用不完全培养液洗1次，1200rpm，离心8分钟；

2.2.4弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响peg的浓度；

2.2.5轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动；

2.2.6在室温下融合：

2.2.6.130秒内加入预热的1mipeg1500，边加边搅拌；

2.2.6.2作用90秒钟；

2.2.6.3加预热的不完全培养液，终止peg作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml；。

2.2.6.4离心，800rpm，6分钟；

2.2.7hat条件培养，以获得杂交瘤细胞株；

融合后细胞沉淀加入3mlimdm1640，10ml胎牛血清(sigma产品)，50×hat1mi，再加入饲养细胞悬液2ml，混匀。加入上述制备的甲基纤维素半固体培养基，混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿2ml。37℃，5％co2孵箱培养1w。

通过上述方法，后经过筛选，我们一共获得了对2株杂交瘤细胞，分别为5b7、37c3。表1为对该两株抗体的鉴定数据。

表1.抗体的型别及亲和力数据和中和活性数据

经过测序分析：所述单克隆抗体5b7的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，其中，轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.1的第26-33位、49-55位、88-96位氨基酸序列所示；轻链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.9所示；

所述单克隆抗体5b7的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.3所示，其中，重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.3的第26-35位、50-65位、99-111位氨基酸序列所示，重链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.11所示；

所述单克隆抗体37c3的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.5所示，其中，轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.5的第24-34位、50-56位、92-98位氨基酸序列所示；轻链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.9所示；

所述单克隆抗体37c3的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.7所示，其中，重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.7的第26-35位、50-66位、99-111位氨基酸序列所示，重链恒定区的氨基酸序列均如seqidno.11所示

实施例3单克隆抗体应用于en2的鉴定

en2单克隆抗体5b7对en2转染293t细胞总蛋白和293t细胞总蛋白以及三种前列腺癌细胞系(lncap，du145，pc3)的western-blotting鉴定。

图3为293t转染en2-rfp融合蛋白后sds-page鉴定图。m为分子量marker，泳道1为转染en2-rfp的293t细胞裂解液，泳道2为空白293t细胞裂解液对照，箭头显示转染后en2-rfp蛋白表达。

图4为western-blotting检测293t转染en2-rfp融合蛋白，抗体为en2单抗。泳道1为转染了en2-rfp的293t细胞裂解液，上面条带为转染的外源en2-rfp蛋白，下面条带为内源性en2蛋白。泳道2为空白293t细胞裂解液，只有内源性en2蛋白目的条带。

图5为三种前列腺癌细胞系(lncap，du145，pc3)总蛋白的en2单抗检测。由图可见，使用en2单抗鉴定三种前列腺癌细胞总蛋白，在33kd左右位置有单一目的条带，大小与293t细胞内源性en2相同，为内源性en2。该单抗可应用于en2的wb鉴定。

细胞免疫荧光实验步骤：

细胞按照1×10⁴/ml接种于24孔板中，次日将en2-rfp表达质粒转染入293t细胞。24小时后，固定细胞，破膜。加入5μg/mlen2单克隆抗体孵育1小时，洗涤后，加入fitc-羊抗小鼠igg孵育1小时，洗涤后，荧光显微镜下观察并拍照(放大倍数为400倍)。

en2单克隆抗体5b7对en2转染293t细胞和三种前列腺癌细胞的免疫荧光检测：图6为en2单抗的免疫荧光，由左至右依次为：en2-rfp转染的293t细胞，en2单抗染色，共定位拟合图。真核表达载体en2-rfp转染293t细胞后，在细胞内en2融合红色荧光蛋白rfp表达，荧光显微镜下观察可见转染阳性的细胞内有红色荧光。使用fitc标记的en2单抗染色，可以结合细胞内en2蛋白，荧光显微镜下观察en2单抗染色阳性的细胞呈绿色。两张图拟合后发现红色和绿色完全重叠，说明en2单抗能够结合转染的en2-rfp蛋白。

图7为外源性和内源性en2蛋白在三种前列腺癌细胞系的亚细胞定位。使用荧光显微镜，外源性en2蛋白由于融合了红色荧光蛋白，显红色。en2单抗标记了fitc，因此，显绿色。由上到下依次是lncap，du145，pc3，由左到右依次是en2-rfp转染荧光图，fitc-en2单抗染色荧光图，merge图。放大倍数为1000倍。

实施例4.en2单克隆抗体5b7对前列腺癌组织标本进行免疫组化。

前列腺癌组织标本免疫组化实验步骤：

将前列腺癌组织石蜡包埋后，切片制成石蜡切片。石蜡切片置于67℃烤片箱，烤片1小时左右，脱蜡至水。依次将石蜡切片浸入二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ、无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、蒸馏水脱蜡水化。用3％过氧化氢孵育10分钟后pbs清洗后进行抗原修复，高压锅中加入1500ml柠檬酸抗原修复液，中火加热至沸腾，放入切片，拧紧高压锅盖，扣上限压阀，中火加热至喷气阀转动开始计时，2.5分钟，停止，自然冷却10分钟以上，自来水冲洗，冷却至室温。pbs洗3次后，切片上滴加足量可覆盖组织块的羊血清封闭液，放置室温孵育30min。倾去血清，加入en2单克隆抗体，4℃孵育过夜。pbst洗3遍之后，滴加山羊抗小鼠igg-hrp，室温孵育30分钟。pbst洗3遍之后，滴加dab显色液，显微镜观察出现棕黄色改变并且颜色深度适当时即可终止显色。苏木精复染10min后自来水洗。盐酸酒精分化液分化2秒，反蓝10分钟。最后依次将石蜡切片放入80％乙醇、95％乙醇、100％乙醇(1)、100％乙醇(2)、二甲苯(1)和二甲苯(2)后使用中性树脂封片。待玻片干燥后显微镜下观察实验结果。

图8为前列腺增生和癌症的代表性的en2免疫组化图，抗体为en2单抗。a代表性的前列腺增生和癌组织。上面三张图为增生组织，下面三张图为癌症组织。ben2染色相对强的前列腺增生组织。左图en2着色特点为膜着色，细胞间界限明显，轮廓分明。细胞内着色浅，但基底部的腺上皮细胞核膜染色明显。i为新生血管内皮细胞膜染色，ii为腺上皮细胞膜，和腺上皮细胞核和核膜(红色箭头所示)染色。右图en2着色特点为腺体和肿瘤新生血管内皮细胞染色明显，结蹄组织内有核染色细胞。iii为腺上皮细胞浆染色，iv为结缔组织内的细胞核染色。该细胞核为圆形，对比该组织的he染色结果，这些结蹄组织中的染色细胞为浸润的淋巴细胞。c代表性的前列腺癌组织。en2染色部位主要集中在腺上皮细胞膜，腺体细胞呈蜂窝状，边界分明。v为腺上皮细胞膜和细胞浆着色。vi为细胞膜着色。vii为细胞核膜着色，红色箭头显示。viii为肿瘤新生血管内皮细胞染色。

实施例5.en2单克隆抗体应用胶体金技术进行前列腺癌病人尿液检测。

胶体金实验步骤

首先将en2单克隆抗体5b7标记胶体金。在滤纸条的硝酸纤维素膜中间使用1ul单克隆抗体37c3点样。取尿液标本50ul，加入到200ul标记有胶体金的5b7抗体中。滤纸条插入标记胶体金的5b7单抗与尿液标本的混合溶液中，使液体沿着滤纸条往上跑，待液体完全跑完后，取出滤纸条室温干燥后，观察实验结果。检测试纸条上出现红色斑点即为阳性。该法特异性高，灵敏度为100ng/ml。

图9胶体金法检测前列腺癌病人尿液中的en2。试条上出现斑点为阳性。即我们制备的单克隆抗体5b7和37c3可以形成检测尿液标本中en2蛋白的双特异性抗体对。标记胶体金的单克隆抗体5b7与尿液标本中的en2蛋白结合后，使用单克隆抗体37c3能够抓定en2蛋白与标记胶体金的单抗5b7的结合物，即在滤纸条上出现阳性斑点。

序列表

<110>北京格根生物科技有限公司

<120>一种抗engrailed-2蛋白单克隆抗体及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>118

<212>prt

<213>musmusculus

<400>1

aspasnglumetthrglnilethralaserleuprovalserleugly

151015

gluargvalserilesercyslyssersergluthrvalthrtyrmet

202530

alatrptyrleuglnlysglnasplysserleuglnleuleuiletyr

354045

asnthrserargleuglnaspglyileproalaargpheserglyser

505560

glyserglythrasptyrserleuasnileserasnleugluproglu

65707580

aspalaglythrtyrphecysglnhisserphethraspprotyrthr

859095

pheglyserglythrlysleugluilelysargthrvallysalapro

100105110

thrvalserilephepro

115

<210>2

<211>354

<212>dna

<213>musmusculus

<400>2

gacaacgagatgacccagatcaccgccagcctgcccgtgagcctgggcgagagggtgagc60

atcagctgcaagagcagcgagaccgtgacctacatggcctggtacctgcagaagcaggac120

aagagcctgcagctgctgatctacaacaccagcaggctgcaggacggcatccccgccagg180

ttcagcggcagcggcagcggcaccgactacagcctgaacatcagcaacctggagcccgag240

gacgccggcacctacttctgccagcacagcttcaccgacccctacaccttcggcagcggc300

accaagctggagatcaagaggaccgtgaaggcccccaccgtgagcatcttcccc354

<210>3

<211>120

<212>prt

<213>musmusculus

<400>3

aspileglnleuvalglnserglyglygluleuvalalaproglyala

151015

servallysilethrcyslysalaserglytyrthrleuglyglnphe

202530

glymethistrpvalargglnalahisglulysaspleuglutrpile

354045

alatyrileserthralaglythraspleuasntyralagluthrphe

505560

lysserargphealaleuservalaspserproalaasnglnvaltyr

65707580

leulysmetthrasnleuglnthrglyaspseralathrtyrphecys

859095

thrasnglyglyaspglythrlysthrleutrptyrpheasptyrtrp

100105110

glyglnglythralaleuthrval

115120

<210>4

<211>360

<212>dna

<213>musmusculus

<400>4

gacatccagctggtgcagagcggcggcgagctggtggcccccggcgccagcgtgaagatc60

acctgcaaggccagcggctacaccctgggccagttcggcatgcactgggtgaggcaggcc120

cacgagaaggacctggagtggatcgcctacatcagcaccgccggcaccgacctgaactac180

gccgagaccttcaagagcaggttcgccctgagcgtggacagccccgccaaccaggtgtac240

ctgaagatgaccaacctgcagaccggcgacagcgccacctacttctgcaccaacggcggc300

gacggcaccaagaccctgtggtacttcgactactggggccagggcaccgccctgaccgtg360

<210>5

<211>120

<212>prt

<213>musmusculus

<400>5

aspvalglnleuthrglnserproleuserleuservalservalgly

151015

aspthralathrilesercysargalaserglnaspiletyrasnphe

202530

leualatrptyrglnglnlysproglyglnserprolyspheleuval

354045

tyrtyralathrasnleualaserglyvalproserargphesergly

505560

trpglyserglythraspphethrleulysilehisservalleuser

65707580

gluaspilealasertyrtyrcyspheglnglytyrglygluleupro

859095

trpthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargalaaspala

100105110

alaproservalgluileleupro

115120

<210>6

<211>360

<212>dna

<213>musmusculus

<400>6

gacgtgcagctgacccagagccccctgagcctgagcgtgagcgtgggcgacaccgccacc60

atcagctgcagggccagccaggacatctacaacttcctggcctggtaccagcagaagccc120

ggccagagccccaagttcctggtgtactacgccaccaacctggccagcggcgtgcccagc180

aggttcagcggctggggcagcggcaccgacttcaccctgaagatccacagcgtgctgagc240

gaggacatcgccagctactactgcttccagggctacggcgagctgccctggaccttcggc300

ggcggcaccaagctggagatcaagagggccgacgccgcccccagcgtggagatcctgccc360

<210>7

<211>120

<212>prt

<213>musmusculus

<400>7

gluvalglnleuglngluserglyproaspleuargglnprosergly

151015

thrleuserleusercysalavalserglypheservalthrasntyr

202530

alametsertrpvallysglnserproglylysglyleuasptrpval

354045

glytyrileserseralaalaseraspileasntyrglyaspserval

505560

hisglylysleuthrilethrarggluasnserlysserthralaphe

65707580

metglnileasnserleulysserasnaspthrglyvaltyrtyrcys

859095

valargglyalaserglyglyargservaltrptyrpheasptyrtrp

100105110

glyglnglyalaservalileval

115120

<210>8

<211>360

<212>dna

<213>musmusculus

<400>8

gaggtgcagctgcaggagagcggccccgacctgaggcagcccagcggcaccctgagcctg60

agctgcgccgtgagcggcttcagcgtgaccaactacgccatgagctgggtgaagcagagc120

cccggcaagggcctggactgggtgggctacatcagcagcgccgccagcgacatcaactac180

ggcgacagcgtgcacggcaagctgaccatcaccagggagaacagcaagagcaccgccttc240

atgcagatcaacagcctgaagagcaacgacaccggcgtgtactactgcgtgaggggcgcc300

agcggcggcaggagcgtgtggtacttcgactactggggccagggcgccagcgtgatcgtg360

<210>9

<211>111

<212>prt

<213>musmusculus

<400>9

leugluilelysargalaaspalaalaprothrvalserilephepro

151015

prosersergluglnleuthrserglyglyalaservalvalcysphe

202530

leuasnasnphetyrprolysaspileasnvallystrplysileasp

354045

glysergluargglnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnasp

505560

serlysaspserthrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlys

65707580

aspglutyrgluarghisasnsertyrthrcysglualathrhislys

859095

thrserthrserproilevallysserpheasnargasnglucys

100105110

<210>10

<211>336

<212>dna

<213>musmusculus

<400>10

ctcgagatcaaacgggcagatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgag60

cagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagac120

atcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttgg180

actgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaag240

gacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttca300

cccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag336

<210>11

<211>327

<212>prt

<213>musmusculus

<400>11

alaserseralalysthrthrproproservaltyrproleualapro

151015

glyseralaalaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleuval

202530

lysglytyrpheprogluprovalthrvalthrtrpasnserglyser

354045

leuserserglyvalhisthrpheproalavalleuglnseraspleu

505560

tyrthrleuserserservalthrvalproserserthrtrpproser

65707580

gluthrvalthrcysasnvalalahisproalaserserthrlysval

859095

asplyslysilevalproargaspcysglycyslysprocysilecys

100105110

thrvalprogluvalserservalpheilepheproprolysprolys

115120125

aspvalleuthrilethrleuthrprolysvalthrcysvalvalval

130135140

aspileserlysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalasp

145150155160

aspvalgluvalhisthralaglnthrglnproargglugluglnphe

165170175

asnserthrpheargservalsergluleuproilemethisglnasp

180185190

trpleuasnglylysgluphelyscysargvalasnseralaalaphe

195200205

proalaproileglulysthrileserlysthrlysglyargprolys

210215220

alaproglnvaltyrthrileproproprolysgluglnmetalalys

225230235240

asplysvalserleuthrcysmetilethraspphepheprogluasp

245250255

ilethrvalglutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlys

260265270

asnthrglnproilemetaspthraspglysertyrphevaltyrser

275280285

lysleuasnvalglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethr

290295300

cysservalleuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysser

305310315320

leuserhisserproglylys

325

<210>12

<211>984

<212>dna

<213>musmusculus

<400>12

gctagcagcgctaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcc60

caaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtg120

acagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctg180

cagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagc240

gagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaatt300

gtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtc360

ttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacg420

tgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagat480

gatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttc540

cgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaa600

tgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaa660

ggcagaccgaaggctccgcaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaag720

gataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggag780

tggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacaca840

gatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcagga900

aatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagc960

ctctcccactctcctggtaaatga984