一种用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型的制作方法

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型。

背景技术：

肿瘤嗜神经侵袭(pni)是肿瘤细胞在神经纤维周围沿着神经侵入神经外膜、神经束膜或神经内膜并延伸的肿瘤局部浸润转移现象。pni是患者预后不良的独立因素，增加了复发的可能性和降低了存活率，常见于鳞状细胞癌，胰腺癌，头颈，结肠和直肠，胆道和胃的恶性肿瘤。它不是一种简单的扩散方式，涉及了神经和肿瘤之间复杂的相互作用，肿瘤细胞可以沿着神经浸润到肿瘤边界之外的距离，并且神经侵袭的发生也与炎性反应和神经性疼痛相关。目前的研究中因为缺少有效的体内或体外模型，使关于神经侵袭机制的研究陷入了瓶颈，驱动肿瘤细胞向神经侵袭的主要机制目前尚不明确。

目前已构建的体外研究模型大多是采用肿瘤细胞与小鼠背根神经节在基质胶(basementmembranematrix)中共培养的方式。基本步骤如下：

1)体外分离小鼠背根神经节；

2)将小鼠背根神经节置于玻片上，并用基质胶将其表面完全覆盖，此过程冰上操作；

3)将含有背根神经节并覆盖了基质胶的玻片置于孔板中，放于37℃培养箱，使基质胶固化；

4)均匀注射肿瘤细胞液于含有基质胶覆盖的背根神经节的孔板中进行共同培养；

5)单独培养背根神经节或单独培养肿瘤细胞作为对照组；

6)定期观察肿瘤细胞和背根神经节的生长状态。

现有技术的缺点是肿瘤细胞和背根神经节处于同一室中共同培养，某些肿瘤细胞在注射进基质胶时已与背根神经节接触，不能反应体内肿瘤嗜神经侵袭时的远距离浸润现象，肿瘤细胞和神经组织共混一室，也很难分辨某些诱导变化是肿瘤细胞的代谢影响的神经还是神经影响的肿瘤，再者孔板中培养，更换培养基使细胞营养有短暂的间断性，不能模拟体内脉管网络血液运输连续性的微环境，微环境的偏差会影响细胞的表达，可能导致某些相关的信号分子不被发现，进而影响实验效果。针对这些缺点本发明的目的即创造更加接近体内真实微环境的体外模拟系统，提高实验结果的准确性和有效性。

本发明中更改了孔板培养方式，结合使用双流式生物反应器双室培养，一室培养肿瘤细胞，一室培养施万细胞或背根神经节或其它神经外植体，在连续性的培养基供应更换条件下并可结合使用其它新型多孔水凝胶支架进行三维培养，高度模拟体内真实的生理微环境。

技术实现要素：

本发明专利主要是设计一种有效的用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外模型，其设计意在模拟一个与体内微环境高度相似的体外组织及细胞培养的三维模型，从而减少优化动物实验，高度符合当下动物伦理中的3r原则，并且可以提高实验结果的有效性，弥合了生理病理及药理研究中细胞分子水平到动物实验及临床实验的鸿沟。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型，包括第一培养基供应瓶、第一泵、第一培养室、第一废液收集瓶、第二培养基供应瓶、第二泵、第二培养室、第二废液收集瓶；第一培养基供应瓶、第一泵、第一培养室和第一废液收集瓶依次连接，第二培养基供应瓶、第二泵、第二培养室和第二废液收集瓶依次连接，第一培养室和第二培养室之间设有第一阀门，第一阀门将第一培养室和第二培养室连接在一起，第一培养室位于第二培养室的左侧。

进一步地，第一培养室和第二培养室结构相同，第一培养室和第二培养室中均设有微孔膜，微孔膜将第一培养室和第二培养室分隔为室上层和室下层，室上层和室下层均设有一进一出两个接口，分别为上进口、上出口、下进口、下出口。

进一步地，微孔膜用于覆盖基质胶或者放置多孔水凝胶支架。

进一步地，第一泵与第一培养室之间、第一培养室与第一废液收集瓶之间、第二泵与第二培养室之间以及第二培养室与第二废液收集瓶之间均设有第二阀门。

进一步地，第一培养室用于培养肿瘤细胞；第二培养室用于培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体。

进一步地，第一培养室用于培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体；第二培养室用于培养肿瘤细胞。

进一步地，模型可建立三种培养模式：1)关闭第一阀门，第一培养室单独培养肿瘤细胞，第二培养室单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，此时模型为两个完全独立的三维培养系统，可单独进行分析检测，作为对照组实验；其中第一培养室和第二培养室内的培养物可调换；

2)打开第一阀门，第一培养室单独培养肿瘤细胞，第二培养室单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，此时模型可模拟体内组织间的分子串音，可以观察肿瘤细胞在上游位置时对神经侵袭的影响，可以检测肿瘤细胞代谢对神经的诱导作用；

3)打开第一阀门，第一培养室单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，第二培养室单独培养肿瘤细胞，此时模型可模拟体内组织间的分子串音，可以观察肿瘤细胞在下游位置时对神经侵袭的影响，可以检测神经细胞代谢对肿瘤细胞的诱导作用。

进一步地，当不需要区分收集第一培养室和第二培养室的代谢产物进行分析时，该模型可以简化为：包括第一培养基供应瓶、第一泵、第一培养室、第二培养室、第一废液收集瓶，第一培养基供应瓶、第一泵、第一培养室、第二培养室、第一废液收集瓶依次连接；或包括第二培养基供应瓶、第二泵、第一培养室、第二培养室、第二废液收集瓶，第二培养基供应瓶、第二泵、第一培养室、第二培养室、第二废液收集瓶依次连接；

第一培养室和第二培养室之间设有第一阀门，所述第一培养室和第二培养室通过第一阀门连接在一起，所述第一培养室位于第二培养室的左侧。

进一步地，第一泵与第一培养室之间、第二培养室与第一废液收集瓶之间或第二泵与第一培养室之间、第二培养室与第二废液收集瓶之间均设有第二阀门。

现有的体外模型主要的缺点是：一、不能反应肿瘤沿神经的远距离浸润现象；二、不能模拟血液连续流通的培养微环境；三、很难探寻肿瘤或神经相关细胞的代谢产物对彼此的影响。本发明的优点在于：一、采用双培养室的模型，一室培养肿瘤细胞，另一室培养神经施万细胞或背根神经节或其它神经外植体，拉开了两者的距离，可以模拟体内组织间的串联，肿瘤细胞远距离向神经侵袭；二、可以调整双培养室的相互位置，对照肿瘤细胞位于神经上游和下游时产生的不同影响；三、本发明是一个连续性地供应和更新培养基的系统，很真实的模拟了体内血液循环，再结合使用多孔水凝胶支架等三维培养方式，更加接近体内真实的生理微环境，使细胞表达更接近体内真实情况。四、该模型还可以进一步用于如何可以及时有效阻断肿瘤向神经侵袭的研究。本发明模型模拟了一个与体内微环境高度相似的体外组织及细胞培养的三维模型，从而减少优化动物实验，高度符合当下动物伦理中的3r原则，并且可以提高实验结果的有效性，弥合了生理病理及药理研究中细胞分子水平到动物实验及临床实验的鸿沟。

附图说明

图1为本发明用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型的结构示意图；

图2为本发明用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型简化后的结构示意图；

图3为本发明第一培养室和第二培养室的结构示意图。

附图标记说明：

1.第一培养基供应瓶，2.第一泵，3.第一培养室，4.第一废液收集瓶，5.第二培养基供应瓶，6.第二泵，7.第二培养室，8.第二废液收集瓶，9.第一阀门，10.微孔膜，11.上进口，12.上出口，13.下进口，14.下出口，15.室上层，16.室下层，17.第二阀门。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的一个具体实施方式进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明的体外培养模型系统不局限于研究肿瘤嗜神经侵袭这一种病理机制，还可拓展应用到其他病理药理机制的研究。

一种用于肿瘤嗜神经侵袭机制研究的体外实验模型，如图1所示，包括第一培养基供应瓶1、第一泵2、第一培养室3、第一废液收集瓶4、第二培养基供应瓶5、第二泵6、第二培养室7、第二废液收集瓶8；第一培养基供应瓶1、第一泵2、第一培养室3和第一废液收集瓶4依次连接，第二培养基供应瓶5、第二泵6、第二培养室7和第二废液收集瓶8依次连接，第一培养室3和第二培养室7之间设有第一阀门9，第一阀门9将第一培养室3和第二培养室7连接在一起，第一培养室3位于第二培养室7的左侧。

第一泵2将第一培养基供应瓶1内的培养基输送进第一培养室3，第一培养室3内代谢后的废液排入第一废液收集瓶4，第一阀门9打开时，也有一部分培养基流经第一培养室3再进入第二培养室7，第二泵6将第二培养基供应瓶5内的新鲜培养基输送进第二培养室7，第二培养室7内代谢的废液排入第二废液收集瓶8。其中可通过调节泵的电压带动的齿轮转速来控制液体流速。

第一培养室3和第二培养室8结构相同，如图3所示，第一培养室3和第二培养室8中均设有微孔膜10，微孔膜10将第一培养室3和第二培养室8分隔室上层15和室下层16，室上层15和室下层16均设有一进一出两个接口，分别为上进口11、上出口12、下进口13、下出口14。微孔膜10用于覆盖基质胶或者放置多孔水凝胶支架。这样第一培养室9和第二培养室7连接后可以同时模拟细胞垂直方向以及水平方向的迁移。

第一泵2与第一培养室3之间、第一培养室3与第一废液收集瓶4之间、第二泵6与第二培养室7之间以及第二培养室7与第二废液收集瓶8之间均设有第二阀门17。这样可以根据实验条件进行开关，来选择控制培养基的流向。

第一培养室3用于培养肿瘤细胞；第二培养室7用于培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体。或第一培养室3用于培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体；第二培养室7用于培养肿瘤细胞。

模型可建立三种培养模式：1)关闭第一阀门9，第一培养室3单独培养肿瘤细胞，第二培养室7单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，此时模型为两个完全独立的三维培养系统，可单独进行分析检测，作为对照组实验；其中第一培养室3和第二培养室7内的培养物可调换；

2)打开第一阀门9，第一培养室3单独培养肿瘤细胞，第二培养室7单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，此时模型可模拟体内组织间的分子串音，可以观察肿瘤细胞在上游位置时对神经侵袭的影响，可以检测肿瘤细胞代谢对神经的诱导作用；

3)打开第一阀门9，第一培养室3单独培养施万细胞或背根神经节或其他神经外植体，第二培养室7单独培养肿瘤细胞，此时模型可模拟体内组织间的分子串音，可以观察肿瘤细胞在下游位置时对神经侵袭的影响，可以检测神经细胞代谢对肿瘤细胞的诱导作用。

当不需要区分收集第一培养室3和第二培养室7的代谢产物进行分析时，该模型可以简化为如图2所示：包括第一培养基供应瓶1、第一泵2、第一培养室3、第二培养室7、第一废液收集瓶4所述第一培养基供应瓶1、第一泵2、第一培养室3、第二培养室7、第一废液收集瓶4依次连接；或包括第二培养基供应瓶5、第二泵6、第一培养室3、第二培养室7、第二废液收集瓶8，所述第二培养基供应瓶5、第二泵6、第一培养室3、第二培养室7、第二废液收集瓶8依次连接；第一培养室3和第二培养室7之间设有第一阀门9，第一培养室3和第二培养室7通过第一阀门9连接在一起，第一培养室3位于第二培养室7的左侧。第一泵2与第一培养室3之间、第二培养室7与第一废液收集瓶4之间或第二泵6与第一培养室3之间、第二培养室7与第二废液收集瓶8之间均设有第二阀门17。第一泵2或第二泵6将第一培养基供应瓶1或第二培养基供应瓶5内的培养基输送进第一培养室3和第二培养室7，最后废液流入第一废液收集瓶4或第二废液收集瓶8。

本发明的具体方案阐述中仅具体地表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，该实验模型并不局限使用于肿瘤嗜神经侵袭机制的研究，还可以用于看肿瘤药物效用的研究以及其它一些涉及多器官组织相互作用的病理机制研究，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。