一种检测人类皮肤抗氧化能力基因型的试剂盒和方法与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测人类皮肤抗氧化能力基因型的试剂盒和方法。

背景技术：

随着全球老龄化的不断发生，科学家们正在试图深入了解人类衰老过程中涉及的生理生化反应。人体的生命活动需要能量，这些能量来自于每天的饮食，食物通过人体的循环系统进入到细胞内，然后释放能量，但在释放能量的同时还会产生大量的自由基。自由基就是导致人类衰老的罪魁祸首，随着年龄的增长，人体便会产生更多的自由基，慢慢的对人体内的细胞产生破坏，导致细胞加速衰老。人体新陈代谢其实是一个氧化的过程，而其中皮肤的变化是最明显的迹象之一，所以越来越多的人开始重视皮肤的抗氧化管理，市场上也随之出现各种具有抗氧化功效的皮肤护理产品。

皮肤的氧化主要由外源因素和内源因素产生的，外源因素一般为环境因素，如紫外线辐射和污染物，紫外线中的uva可以穿透角质层，进入皮肤内部，破坏细胞组织，细胞受到刺激后，会产生应激反应，产生大量的自由基，加速破坏人体正常组织；而内源因素主要是个体的对自由基的代谢水平。大量研究已经证实，人体内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统，它包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等一些酶和维生素c、维生素e、还原性谷胱甘肽、胡萝卜素和硒等一些抗氧化剂。酶类物质可以使体内的活性氧自由基变为活性较低的物质，从而削弱它们对机体的攻击力。这些物质就深藏于我们体内，只要保持它们的量和活力它们就会发挥清除多余自由基的能力，使我们体内的自由基保持平衡。整个抗氧化的系统是一个稳态的平衡，一旦这个平衡被破坏，皮肤就会干燥，老化，甚至会引发严重的疾病。

在皮肤抗氧化的过程中，可以通过两种途径来降低自由基对人体带来的危害。一种是阻挡外源的侵害，紫外线和环境污染等外源因素可以通过物理防晒和隔离等方法进行阻挡；另一种是提升内源性自由基清除系统的能力，但是这种能力是因人而异的，因为每个人对自由基的代谢能力不尽相同。而随着人类基因组测序的发展，科学家们已经在分子水平上发现了一些有助于研究皮肤抗氧化能力的信息。

人类遗传基因的差异与皮肤抗氧化能力有着密切的关系，而snp(单核苷酸多态性)是人类可遗传的变异中最常见的一种，它是因为单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。研究人员从数据库中筛选出几个与皮肤抗氧化相关的基因：nfe2l2基因可以调控一系列抗氧化等多种保护性基因的表达，从而调控机体内氧化还原平衡，维持组织细胞正常生理活动；nq01基因通过编码还原型辅酶来还原解毒内源性和外源性毒物；sodii基因编码超氧化物歧化酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞；gpx1基因编码一种谷胱甘肽过氧化酶，将脂类过氧化物还原为相应的醇，并将游离的过氧化氢还原为水，在生物体中起到解毒作用。经过大量的数据分析，发现了能够影响皮肤抗氧化能力的snp位点。基因nq01中位点rs1800566多态c等位基因比t抗氧化能力强；基因sod2中位点rs4880多态c等位基因比t抗氧化能力强；基因nfe2l2中位点rs35652124和rs6706649多态c等位基因比t抗氧化能力强，位点rs6721961多态g等位基因比t抗氧化能力强；基因gpx1中位点rs1050450多态t等位基因比c抗氧化能力强。当6个snp中抗氧化能力强的基因型的个数大于抗氧化能力弱的基因型个数时，说明皮肤的抗氧化能力较强；反之，抗氧化能力强的基因型的个数小于抗氧化能力弱的基因型个数时，说明皮肤的抗氧化能力较弱。

目前，市场上销售的各种抗氧化的皮肤护理的产品都有效果因人而异的标识，虽然都进行过大量的测试，但是还是有一定的局限性。每一个的人对抗氧化有效成分的接受和吸收程度是不同的。因此通过检测与皮肤抗氧化能力相关的这6个snp位点的基因型能够了解自身皮肤的抗氧化能力，从而选择更适合自己的护肤品，更有效地吸收其中的营养。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测人类皮肤抗氧化能力基因型的试剂盒和方法，该试剂盒能对受测者的相关基因进行检测，并给出分析。

具体地，本发明公开了一种检测人类皮肤抗氧化能力基因型的试剂盒和方法，包括如下步骤：

a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行dna核酸提取；

b)取受测者唾液采集卡样本或提取的dna样本加入到反应体系中，进行pcr扩增；

c)运行扩增程序；

d)对扩增产物进行电泳分析，并根据峰型图进行判读；

本试剂盒包含以下几个组分：primermixa、primermixb、pcr反应液和dna/rna-free水。

其中的primermixa和b中，包含扩增6个snp位点的引物组及3个人类基因组dna内参和反应内参pcdna的引物组，详见表1。

本试剂盒可对受测样本进行同步多重pcr扩增，通过snp引物的设计，可以精确测出被检测基因nq01、sod2、nfe2l2和gpx1的6个snp的基因型；pcdna用以检测反应体系，监控反应体系是否有效，扩增是否正常；3个人体基因组dna内参用以检测人体样本，保证人体样本有效。

其中pcr反应液包含以下组分：2×pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps、氯化钾、氯化镁等。

本试剂盒的pcr扩增反应条件见表2。

表2本发明的pcr扩增反应条件

本试剂盒的扩增产物通过电泳对扩增产物进行分析；优选的电泳为毛细管电泳。

本试剂盒可同时扩增多个位点，实现检测的简易性、高效性和特异性，通过分析扩增图谱分析为受测者的皮肤抗氧化能力提供参考，见表3。

表3本发明的检测位点-皮肤抗氧化能力参考信息

附图说明

图1a和图1b是受测者1口腔脱落细胞样本扩增图谱。nq01基因型为ct；sod2为t；gpx1基因型为c；nfe2l2基因rs35652124位点的基因型为tc；nfe2l2基因rs6706649位点的基因型为c；nfe2l2基因rs6721961位点的基因型为tg，出现pcdna峰及人基因组dna(hudna)内参-1、人基因组dna(hudna)内参-5、人基因组dna(hudna)内参-7特征峰。

图2a和图2b是受测者2口腔脱落细胞样本扩增图谱。nq01基因型为c；sod2为t；gpx1基因型为c；nfe2l2基因rs35652124位点的基因型为t；nfe2l2基因rs6706649位点的基因型为ct；nfe2l2基因rs6721961位点的基因型为g，出现pcdna峰及人基因组dna(hudna)内参-1、人基因组dna(hudna)内参-5、人基因组dna(hudna)内参-7特征峰。

图3a和图3b是受测者1血液提取dna样本扩增图谱。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

检测皮肤抗氧化能力的试剂盒，包括盒体和盒体内存放的试剂，包括如下步骤：

a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行dna核酸提取；

b)取受测者唾液采集卡样本或提取的dna样本加入到反应体系中，进行pcr扩增；

c、)运行扩增程序；

d)对扩增产物进行电泳分析，并根据峰型图进行判读；

本试剂盒包含以下几个组分：primermixa、primermixb、pcr反应液和dna/rna-free水。

其中的primermixa和b中，包含扩增6个snp位点的引物组及3个人类基因组dna内参和反应内参pcdna的引物组，其中pcr反应液包含以下组分：2×pcr缓冲液、dna聚合酶、dntps、氯化钾、氯化镁等。

在实施案例中，所述的样本为受测者1口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者2口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者1血液dna提取样本。

在实施案例中，所述的电泳是通过毛细管电泳对扩增产物进行电泳，并结合扩增图谱来分析受测者皮肤的抗氧化能力。

实施例一

(1)所选样本：受测者1和受测者2的口腔内壁脱落细胞样本。

(2)样本采集

采集类型：口腔内壁脱落细胞。

采集方法：采用唾液采集棒在口腔内壁上来回擦拭4次，用唾液采集棒的反面继续在口腔内壁上来回擦拭4次，取出唾液采集棒，在唾液样本采集卡上反复按压，将唾液内壁细胞转移到唾液样本采集卡上，并将已经采集好的唾液样本采集卡在无污染区域作晾干处理。

有效样本：唾液样本采集卡的粉色区域变成浅粉色或白色的区域为有效唾液样本区域。

选取样本方法：利用达博塑料打孔器(1.0mm)进行手动打孔取样。

(3)体系配置

将pcr反应液分别与引物primermixa和primermixb按照说明书比例进行反应体系的配置，涡旋混匀后，用离心机离心，然后用移液枪按体积进行分装。

(4)加入样本：用打孔器取唾液卡中的有效样本1～2个，加入到配置好的反应体系中。

(5)扩增程序

pcr仪器上的扩增程序为如表2。

(6)扩增产物在3500dx遗传分析仪上检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(size-500)组成上样混合物{(1μlsize-500+12μl去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μl上样混合物与1μl扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用abi3500遗传分析仪(购自美国abi公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果分别为图1和图2。

(7)分析数据

本次实验中所使用的是受测者样本，根据各目的峰在图谱中出现的位置，确定该受测者的基因型，进而分析受测者皮肤的抗氧化能力。

图1a和b为受测者1唾液样本的分析图谱，图2a和b为受测者2唾液样本的分析图谱。

根据图1分析如下：

受测者1扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：nq01基因型为ct；sod2为t；nfe2l2基因rs35652124位点的基因型为tc；gpx1基因型为c；nfe2l2基因rs6706649位点的基因型为c；nfe2l2基因rs6721961位点的基因型为tg，出现pcdna峰及人基因组dna(hudna)内参-1、人基因组dna(hudna)内参-5、人基因组dna(hudna)内参-7特征峰。

其中nq01基因位点c显示为nq01c，位点t显示为nq01t；sod2基因位点t显示为sod2t；nfe2l2基因rs35652124位点t显示为nfe2l21t，位点c显示为nfe2l21c；gpx1基因型位点c显示为gpx1c；nfe2l2基因rs6706649位点c显示为nfe2l22c；nfe2l2基因rs6721961位点t显示为nfe2l23t，位点g显示为nfe2l23g；pcdna位点为单峰；人基因组dna(hudna)内参-1为单峰，图谱中显示b1；人基因组dna(hudna)内参-5为单峰，图谱中显示b5；人基因组dna(hudna)内参-7位点为单峰，图谱中显示b7。

参考表3，1号受测者除了nfe2l2基因rs6706649位点的基因型c能增强皮肤抗氧化能力外，其余都为降低抗氧化能力的基因型，因此综合6个snp的结果，1号受测者皮肤抗氧化能力较差，可适当用抗氧化成分较多的护肤品进行护理。

图2为受测者2唾液样本的分析图谱。

受测者2扩增产物电泳图谱出现以下特征峰：nq01基因型为c；sod2为t；nfe2l2基因rs35652124位点的基因型为t；gpx1基因型为c；nfe2l2基因rs6706649位点的基因型为ct；nfe2l2基因rs67219619位点的基因型为g，出现pcdna峰及人基因组dna(hudna)内参-1、人基因组dna(hudna)内参-5、人基因组dna(hudna)内参-7特征峰。

其中nq01基因位点c显示为nq01c；sod2基因位点t显示为sod2t；nfe2l2基因rs35652124位点t显示为nfe2l21t；gpx1基因型位点c显示为gpx1c；nfe2l2基因rs6706649位点c显示为nfe2l22c，位点t显示为nfe2l22t；nfe2l2基因rs6721961位点g显示为nfe2l23g；pcdna位点为单峰；人基因组dna(hudna)内参-1为单峰，图谱中显示b1；人基因组dna(hudna)内参-5为单峰，图谱中显示b5；人基因组dna(hudna)内参-7位点为单峰，图谱中显示b7。

参考表3，2号受测者nq01和nfe2l2基因rs6721961位点基因型可增强皮肤抗氧化能力，其余4个均为降低皮肤抗氧化能力的基因型，因此受测者2的皮肤抗氧化能力也比较差，但是略优于1号受测者，可也适当使用抗氧化成分较多的护肤品进行护理。

实施例二

(1)所选样本：受测者1的血液样本。

(2)样本类型：血液样本。

(3)提取dna：利用核酸提取仪对血液样本进行dna提取。

(4)体系配置

将pcr反应液分别与引物primermixa和primermixb按照说明书比例进行反应体系的配置，涡旋混匀后，用离心机离心，然后用移液枪按体积进行分装。

(5)加入样本：按照说明书，用移液器取一定量的提取dna样本，加入到反应体系中。

(6)扩增程序

pcr仪器上的扩增程序为如表2。

(7)扩增产物在3500dx遗传分析仪上检测

由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(size-500)组成上样混合物{(1μlsize-500+12μl去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μl上样混合物与1μl扩增产物混合，避免产生气泡，尽快电泳。用abi3500遗传分析仪(购自美国abi公司)检测分析，具体分析参数为进样电压：1.2kv，进样时间：15s，电泳时间1210-1500s。检测结果分别图3所示。

(8)分析数据

图3为受测者1的血液提取dna样本分析图谱，nq01的基因型为ct；sod2基因型为tt；nfe2l2基因rs35652124位点的基因型为tc；gpx1的基因型为cc；nfe2l2基因rs6706649位点的基因型为cc；nfe2l2基因rs6721961位点的基因型为tg，与图1一致，说明该检测试剂盒同样适用于血样提取的dna样本。