一种检测牛细小病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一株牛细小病毒vp2蛋白单克隆抗体，还涉及利用该单克隆抗体建立的用于牛细小病毒检测的双抗体夹心elisa方法及试剂盒。本发明属于生物技术领域。

背景技术：

牛细小病毒(bovineparvovirus，bpv)是细小病毒科(parvoviridae)细小病毒亚科(parvovirinae)牛犬细小病毒属(bocavirus)，主要分为两种bpv-1和bpv-2。牛细小病毒病是一种接触性传染病，主要导致妊娠母牛流产、死胎，犊牛主要表现为肠炎腹泻。感染牛细小病毒对母牛生殖器官及犊牛的呼吸器官、消化器官有较大影响。有研究报道，对bpv感染的牛群进行病毒分离鉴定和血清学调查，结果表明这些牛群中bpv感染发病率较高。

1961年，abinantiden和warfield从患腹泻病犊牛的粪便和健康犊牛的消化器官中分离出细小病毒。因其具有血细胞吸附性能，故称其为血细胞吸附肠炎病毒，最初牛细小病毒感染是在美国发现的。1973年，日本稻叶等从发热、下痢的育成牛群中分离出了与haden不同的另一种牛细小病毒，前者称为1型，后者称为2型。目前，牛细小病毒感染主要在美国、日本、阿尔及利亚等少数国家的牛群中发生。其中2型仅见于日本。抗体调查结果表明，美国牛群阳性率为64-86％，而阿尔及利亚则为70％。

目前，检测牛细小病毒的常规方法为电镜技术、病毒分离、血清学检测、分子生物学方法以及免疫荧光法。透射电子显微镜观察的是组织、细胞、生物大分子、病毒、细菌等结构。能够清晰的观察到病毒粒子，是一种非常直观的检测病毒的方法。但是电子显微镜的成本较高且维护需要较大的费用，仪器操作较为复杂，对于检测样本也有一定的要求，这就导致了这种方法的推广有很大的局限性。牛细小病毒的培养需要较幼龄的细胞或者处于有丝分裂时期的细胞，对于传代细胞系选择范围较少，同时对于培养环境及培养时所需血清要求较高。病毒接种后到出现病变的时间较长，通常还需要盲传3-4代来观察病变的产生。这种方法耗费时间较长，同时需要较为复杂的培养条件，因此病原分离法不太适合用于临床检测。免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来进行诊断的方法，根据荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。间接免疫荧光法可以通过抗原抗体反应的原理检测抗原。然而，免疫荧光法造价过高，操作步骤复杂，需要操作人员具有较高的专业水平不适合推广。分子生物学常用方法有传统pcr方法和荧光定量pcr方法，例如，2012年，罗济冠建立了lamp方法检测牛细小病毒，对病毒的最低检出量为9个拷贝(罗济冠.牛细小病毒检测试剂的制备及快速检测方法的建立[d].哈尔滨:东北农业大学硕士学位论文,2012:2-13.)。2010年，baeje等建立了检测牛细小病毒(bpv)、鼠细小病毒(mvm)、牛疱疹病毒(bhv)的多重pcr检测方法，对bpv最低检测量为7.23×10²tcid50/ml(baeje,kimis.multiplexpcrforrapiddetectionofminutevirusofmice,bovineparvovirus,andbovineherpesvirusduringthemanufactureofcellculture-derivedbiopharmaceuticals[j].biotechnology&bioprocessengineering,2010,15(6):1031-1037.)。2009年，武汉三利生物技术有限公司建立了检测牛细小病毒的荧光定量pcr方法，其检测灵敏度为100copies(monteithhd,shannonee,derbyshirejb.theinactivationofabovineenterovirusandabovineparvovirusincattlemanurebyanaerobicdigestion,heattreatment,gammairradiation,ensilageandcomposting[j].journalofhygiene,1986,97(1):175-184.)。2008年，leedh等建立了检测牛细小病毒的荧光定量pcr方法，对bpv最低检测量可达到1.3×10⁰tcid50/ml(leedh,leejh,kimck,etal.real-timepcrforquantitativedetectionofbovineparvovirusduringmanufactureofbiologics[j].koreanjournalofmicrobiology&biotechnology,2008,36(3):173-181.)。但这种方法的原理都是通过扩增目的基因，需要从病料中提取核酸，而且对于提取样本的核酸浓度有一定的要求，且pcr方法存在一定的假阳性。

血清学检测方法具有良好的特异性，目前已广泛用于各种病毒病的临床诊断。已有研究报道，建立了检测牛细小病毒血清抗体的间接elisa方法，该方法具有良好的特异性和重复性(罗济冠.牛细小病毒检测试剂的制备及快速检测方法的建立[d].哈尔滨:东北农业大学硕士学位论文,2012:2-13.)。本发明利用bpvvp2单抗为检测抗体，bpvvp2多抗作为捕获抗体，建立一种快速检测牛细小病毒的双抗体夹心elisa方法，反应中抗原与两种抗体不同抗原决定簇结合，大大提高了检测的特异性，检测结果可信度更高。同时，阴性对照和阳性对照的设置保证了每次试验重复时的准确性。双抗体夹心elisa方法检测时可保证每次操作步骤相同，大量样品检测都处于同一反应体系中，可将操作过程中的误差降到最低。此外，双抗体夹心elisa方法的操作步骤简单，耗费时间短，对于试验人员的专业要求相对较低。用于双抗体夹心elisa方法的试剂非常普遍，试剂价格便宜，使得双抗体夹心elisa方法具有普适性，并可用于大批量样品的检测。与传统方法相比，更具优势，更适合在临床检测中推广。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一株能够分泌抗牛细小病毒vp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

本发明的目的之二是利用上述单克隆抗体建立一种可用于牛细小病毒检测的双抗体夹心elisa方法及试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明根据ncbi公布的牛细小病毒vp2基因序列设计引物，通过pcr扩增获得vp2基因片段，将其与表达载体连接，构建了pprohta-bpv-vp2重组表达载体，转化后筛选获得重组大肠杆菌，通过诱导表达获得bpvvp2蛋白，将其纯化后免疫小鼠(100μg/只)，经过细胞融合、克隆和筛选共获得了五株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为5g9、2b5、6a3、7e8和2b6，经鉴定，分泌抗体亚型分别为igg2a，igg2b，igm，igm和iga，且五株细胞株均能稳定分泌抗bpvvp2蛋白的单克隆抗体。间接免疫荧光检测，五株单克隆抗体与bpv均可发生特异性反应，显示特异性荧光。且特异性试验结果表明，五株单克隆抗体与brv、prv、tgev和pedv均不发生反应。五株杂交瘤细胞5g9、2b5、6a3、7e8和2b6分泌单抗效价分别为1：1000、1：1200、1：500、1：800、1：600，其中2b5株单抗效价最高。

选择效价较高的5g9、2b5分别建立双抗体夹心elisa方法：将纯化后的bpvvp2蛋白免疫新西兰兔，制备兔抗bpvvp2多抗。经ge柱纯化后，通过sds-page检测，表明已获得了纯度较高的bpvvp2多抗。利用制备的抗bpvvp2蛋白的单克隆抗体和兔抗bpvvp2多抗建立双抗体夹心elisa方法，通过对反应条件进行优化，最终确定多抗最佳稀释倍数为1：3200，单抗上清最佳稀释倍数为1：20，最佳包被条件为37℃包被2h，最佳封闭液为5％脱脂乳，最佳封闭时间为2h，最佳抗原孵育时间为2h。双抗体夹心elisa方法的特异性检测结果表明，除bpv检测为阳性，与其它病毒brv、prv、tgev、pedv均不发生反应，显示了良好的特异性。灵敏性试验结果显示，两种方法对病毒的最低检出量分别为6.25×10^2.8tcid50/ml和3.125×10^2.8tcid50/ml，表明基于2b5建立的双抗体夹心elisa方法的检测灵敏性更高。且重复性试验的变异系数均在10％以下，表明建立的双抗体夹心elisa方法具有良好的重复性。通过对临床样品的检测，结果表明本发明建立的双抗体夹心elisa方法与pcr结果一致。

在上述研究的基础上，本发明首先提出了一种分泌抗牛细小病毒vp2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为2b5，分类命名为分泌牛细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号为:cgmccno.18896，保藏时间为2019年11月18日。

进一步的，本发明还提出了一种抗牛细小病毒vp2蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

进一步的，本发明还提出了所述的杂交瘤细胞株以及所述的单克隆抗体在制备检测或诊断牛细小病毒感染试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种检测牛细小病毒的双抗体夹心elisa试剂盒，所述的试剂盒包括本发明所述的单克隆抗体以及兔抗牛细小病毒vp2蛋白多克隆抗体，其中所述的单克隆抗体作为检测抗体，兔抗牛细小病毒vp2蛋白多克隆抗体作为捕获抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒还包括酶标二抗、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的酶标二抗为hrp标记的山羊抗小鼠igg，所述的封闭液是将5g脱脂乳定容于100mlpbs缓冲液中后得到；所述的稀释液是将2.93gnahco3、1.5gna2co3、定容于1l去离子水中，ph调至9.6后得到；所述的洗涤液是将0.2gkh2po4、2.9gna2hpo4·12h2o、8.0g氯化钠、0.2gkcl、0.5mltween-20，定容于1l去离子水中，ph调至7.4后得到；所述的显色液为tmb底物显色液，所述的终止液为2mh2so4。

其中，优选的，所述的试剂盒用于检测或诊断牛细小病毒感染时，按照以下步骤进行：

(1)将兔抗牛细小病毒vp2蛋白多克隆抗体以稀释液稀释后，每孔加入100μl，37℃包被2h；每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(2)每孔加入封闭液200μl，37℃封闭2h，每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(3)将待测样本溶液加入elisa板中，设置平行孔，37℃作用2h；每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；同时设置阳性对照以及阴性对照；

(4)将抗牛细小病毒vp2蛋白单克隆抗体用含5％w/v脱脂乳的pbs缓冲液稀释后，加入elisa板中，每孔100μl，设置平行孔，37℃作用2h；每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(5)加入1：5000倍稀释的hrp标记的山羊抗小鼠igg，37℃作用1h，每孔加入200μl洗涤液，洗涤3次，每次5min；

(6)每孔加入tmb底物显色液100μl，37℃显色5min；

(7)加入2mh2so4终止液，每孔50μl，读取od450nm数值。

其中，优选的，兔抗牛细小病毒vp2蛋白多克隆抗体的稀释倍数为1：3200，单克隆抗体的稀释倍数为1：20。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明使用纯化后的兔抗bpvvp2蛋白多克隆抗体作为捕获抗体，抗bpvvp2蛋白单克隆抗体作为检测抗体，建立了双抗体夹心elisa方法。将双抗体夹心elisa方法的反应条件和试剂进行优化，提高了检测的敏感性和特异性，使得双抗体夹心elisa方法的检测结果更加准确。建立了双抗体夹心elisa方法。特异性试验结果表明该方法特异性良好，与brv、prv、pedv和tgev均不发生反应。灵敏性试验表明该方法对病毒的最低检出量为3.125×10^2.8tcid50/ml。重复性试验表明该方法变异系数均小于10％，确定该方法具有良好的重复性。通过对临床样品的检测发现，双抗体夹心elisa方法与pcr方法的检测结果一致，符合率为100％。综上，本发明建立的双抗体夹心elisa方法特异性强、稳定性好、耗时少，且成本低廉，可用于牛细小病毒的诊断，并为牛细小病毒感染的防控提供一种快速检测方法和监测手段。

附图说明

图1为重组表达载体的pcr鉴定结果；

注：m:8000dnamarker；1:pprohta-bpv-vp2质粒pcr；2:水对照；

图2为重组表达载体的酶切鉴定结果；

注：m：dnamarkerdl8000；1：pprohta-bpv-vp2sali单酶切；2：pprohta-bpv-vp2hindiii单酶切；3：pprohta-bpv-vp2sali,hindiii双酶切；

图3为vp2蛋白表达的sds-page鉴定结果；

注：m：预染蛋白marker；1.：pprohta-bpv-vp2/rosetta诱导后；2：pprohta-bpv-vp2/rosetta诱导前；

图4为目的蛋白表达的westernblot鉴定结果；

注：m：预染蛋白marker；1.：pprohta-bpv-vp2/rosetta诱导后；2：pprohta-bpv-vp2/rosetta诱导前；

图5为纯化后vp2蛋白的sds-page鉴定结果；

注：m：预染蛋白marker；1：纯化后的bpvvp2蛋白；

图6为纯化后vp2蛋白的westernblot鉴定结果；

注：m：预染蛋白marker；1：纯化后的bpvvp2蛋白；

图7为5g9、2b5、6a3、7e8和2b6和sp2/0细胞染色体计数结果

图8为5g9、2b5、6a3、7e8和2b6的westernblot鉴定结果

图9为单克隆抗体间接免疫荧光鉴定结果；

图10纯化后多抗sds-page鉴定结果；

注：m：低分子量蛋白marker；1：兔抗bpvvp2多抗纯化；

图11为多抗最佳包被条件的确定；

图12为封闭液的确定；

图13为封闭时间的确定；

图14为抗原孵育时间的确定；

图15为特异性试验结果；

图16为临床样品的pcr检测结果；

注：m：8000dnamarker；1～8：临床样品(样品编号分别为：12、16、35、49、50、51、71、81)；9：阳性对照；10：阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1单克隆抗体的制备及双抗体夹心elisa检测方法的建立

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌感受态tg1、bl21；pprohta表达载体购自neb公司。

1.1.2细胞与病毒

bt传代细胞(10代)以及bpv-1株均来自于本教研室。

1.1.3实验动物

6周龄spf级balb/c雌鼠(体重为15～20g)、体重2～3公斤的健康雌性家兔均购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.4主要试剂

表1主要试剂

1.1.5主要试剂的配制

1.1.5.1细胞培养液以及细胞融合所需试剂配方

(1)双抗：将100万单位的青霉素和100万单位的链霉素定容于100ml超纯水中并混合均匀，用0.22μm滤器过滤，4℃备用。

(2)l-谷氨酰胺：称量2.97g粉末定容于100ml超纯水中，使用0.22μm滤器过滤，4℃备用。

(3)完全1640培养液：390ml基础1640培养液中加入100ml胎牛血清、5mll-谷氨酰胺和5ml双抗，4℃备用。

(4)hat培养液：380ml基础1640培养液中加入100ml胎牛血清、5mll-谷氨酰胺、5ml双抗和10ml50×hat，4℃备用。

(5)sp2/0细胞培养液：410ml基础1640培养液中加入80ml胎牛血清、5mll-谷氨酰胺和5ml双抗，4℃备用。

1.1.5.2蛋白质电泳试剂配方

(1)5×sdsbuffer：2gsds，25mltris-hcl(6.057gtris-base，去离子水50ml，hcl调至ph＝6.8)，0.5g溴酚蓝，50ml甘油，5mlβ-巯基乙醇，定容于100ml去离子水中。

(2)30％丙烯酰胺：17.4g丙烯酰胺，0.6gn、n-亚甲基双丙烯酰胺，定容于60ml去离子水中，使用滤纸过滤，4℃避光保存备用。

(3)10％sds：10gsds定容于100ml去离子水中，并将ph调至7.2。

(4)10％过硫酸铵：1g过硫酸铵定容于10ml去离子水中。

(5)1mo1/ltris-hcl(ph6.8)：6.057gtris-base，定容于50ml去离子水中，ph调至6.8。

(6)1.5mo1/ltris-hcl(ph8.8)：9.09gtris-base，定容于50ml去离子水中，ph至调8.8。

(7)电泳缓冲液：7.5gtris-base、2.5gsds、47g甘氨酸，定容于500ml蒸馏水中。

(8)考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝r250溶解于45ml蒸馏水、45ml甲醇、10ml冰乙酸的混合液中。

(9)脱色液：100ml冰乙酸、300ml甲醇、600ml蒸馏水混合均匀。

1.1.5.3westernblot试剂配方

(1)pbst洗涤液：0.2gkh2po4、2.9gna2hpo4·12h2o、8.0g氯化钠、0.2gkcl、0.5mltween-20，定容于1l去离子水，ph调至7.4。

(2)转印buffer：0.37gsds、5.8gtris-base、2.9g甘氨酸，定容于1l去离子水中。

(3)封闭液：5g脱脂乳定容于100mlpbs缓冲液中。

1.1.5.4elisa试剂配方

(1)pbst洗涤液：0.2gkh2po4、2.9gna2hpo4·12h2o、8.0g氯化钠、0.2gkcl、0.5mltween-20，定容于1l去离子水中，ph调至7.4。

(2)包被稀释液：2.93gnahco3、1.5gna2co3、定容于1l去离子水中，ph调至9.6。

(3)封闭液：5g脱脂乳定容于100mlpbs缓冲液(ph7.4)中。

(4)tmb底物显色液：2.5mla液、2.5mlb液，使用前加入2μlc液，现用现配并避光保存。

(5)终止液：2mh2so4，将200ml浓硫酸加入到800ml蒸馏水中，注意边加酸时要缓慢并将混合液置于冰水中降温防止溅出。

1.1.5.5蛋白纯化试剂及配方

蛋白纯化试剂为溶液i、溶液ii、溶液iii(表2)，以上三种试剂均定容于100ml蒸馏水中，ph调至8.0。

表2蛋白纯化试剂

1.1.5.6间接免疫荧光相关试剂及配方

(1)4％多聚甲醛：4g多聚甲醛定容于100mlpbs溶液中，加入naoh促进溶解，如果不溶解可以置于水浴锅中60℃水浴，4℃备用。

(2)0.2％triton-100：2μltriton-100溶于1mlpbs溶液中，现用现配。

(3)0.3％bsa：0.03gbsa溶于1mlpbs溶液中，现用现配。

(4)3％bsa：100μl0.3％bsa加入900μlpbs溶液中混合均匀，现用现配。

1.1.5.7杂交瘤细胞染色体计数试剂及配方

(1)0.075mol/lkcl溶液：0.56gkcl定容于100ml去离子水中。

(2)固定液：3ml甲醇与1ml冰醋酸混合均匀，现用现配。

(3)20μg/ml秋水仙素溶液：1g秋水仙素定容于50ml灭菌蒸馏水中。

1.2试验方法

1.2.1bpvvp2基因的获得

1.2.1.1病毒核酸的提取

将bpv的细胞培养物反复冻融三次，并提取dna，步骤如下：

(1)取20μlproteinasek加入到一个无菌离心管中。

(2)在离心管中加入200μl样品。

(3)加入200μlbb5(包含5.6μgcarrierrna)，涡旋混合15s。

(4)56℃孵育15min。

(5)加入250μl无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀)，涡旋混合15s，室温放置5min。

(6)将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000×g离心1min，彻底去除残留的乙醇。

(7)加入500μlwb5，12000×g离心1min，弃掉流出液。

(8)重复步骤7一次。

(9)室温12000×g离心1min，彻底去除残留的乙醇。

(10)将离心柱转入一个新的1.5mlrnase-free的离心管中，并向离心柱中央加20-50μlrnase-freewater，1min。

(11)室温12000×g离心1min，洗脱dna。

(12)将dna于-40℃保存。

1.2.1.2pcr扩增vp2基因

pcr反应条件如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，72℃终延伸4min，共30个循环。pcr扩增体系总体积为50μl，反应体系如表3。

表3pcr反应体系

其中：上游引物的核苷酸序列为：5'-cgacctacaggactttgtggtga-3'下游引物的核苷酸序列为：5'-gaaagcttatggaggtatcaaatgatatacctaac-3'

1.2.2构建表达bpvvp2蛋白的重组大肠杆菌

1.2.2.1重组表达载体的构建

将目的基因与表达载体pproexhta连接，并对重组表达载体进行鉴定。使用sali和hindiii内切酶对重组表达载体进行双酶切，酶切体系见表4，总体积为50μl。pcr鉴定反应条件与反应体系同1.2.1.2。将鉴定正确的质粒送测序。得到的载体命名为pprohta-bpv-vp2。

表4双酶切体系

1.2.2.2重组表达载体的转化

将测序正确的重组表达载体pprohta-bpv-vp2转化到rosseta感受态当中，具体步骤如下：

(1)取出大肠杆菌rosseta感受态，置于冰浴中融化5min。

(2)将2ulpprohta-bpv-vp2和200ul感受态在无菌条件下混匀，冰浴30min。

(3)42℃热击90s。

(4)冰浴5min。

(5)无菌条件下加入lb液体培养基500ul。

(6)37℃培养60min。

(7)吸取200ul涂于lb固体培养基。

(8)在恒温培养箱中37℃培养12h，得到重组大肠杆菌pprohta-bpv-vp2/rosetta。

1.2.3免疫原的制备

1.2.3.1重组大肠杆菌的诱导表达

(1)将重组大肠杆菌pprohta-bpv-vp2/rosetta划线于lb固体培养基培养基，活化后，挑取单菌落接种于氨苄抗性的lb培养基中，扩大培养至100ml。每隔半小时测一次od600值；

(2)当od600值达到0.4～0.6时，加入终浓度为0.002mmol/l的iptg诱导，37℃诱导4h，每隔半小时测一次od600值，待菌液od600值达到1.0时，停止诱导；

(3)取100ml诱导后的菌液通过4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，并用10mlpbs液重悬菌体沉淀；

(4)重悬后的菌液于4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，并用8mlpbs液重悬；

(5)重复步骤4；

(6)重悬液中加1.6ml溶菌酶，37℃作用30min；

(7)使用超声仪将菌体超声破碎40min，程序为超声4s暂停4s；

(8)超声结束后，悬液于4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，加入8ml溶液i将沉淀悬起，37℃作用1h；

(9)重悬后的悬液于4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，每100ml菌液中加8ml溶液ii，将沉淀悬起，37℃作用1h；

(10)重悬后的悬液于4℃低温离心机5000×g离心10min，弃去上清，每100ml菌液加1.6ml溶液iii，将沉淀悬起，以1：1的比例加入2×sds-page上样缓冲液(含dtt)，煮沸15min，-40℃保存备用；

1.2.3.2重组大肠杆菌表达的鉴定

将诱导前和诱导后的大肠杆菌分别超声处理并加入2×sds-page上样缓冲液(含dtt)煮样。获得的蛋白样品进行sds-page电泳分析鉴定目的蛋白表达情况。然后进行westernblot鉴定，一抗his抗体，二抗使用hrp标记的山羊抗鼠igg。

1.2.3.3bpvvp2蛋白的纯化及鉴定

将保存的蛋白样品通过切胶纯化，具体方法如下：将电泳后的蛋白胶使用预冷的kcl显色10s，将目的蛋白条带切下，于电泳槽中电洗脱(100v正向电泳2h反向电泳30min)，然后透析去除其他离子。最后测定蛋白浓度，于-40℃保存。

取纯化后的bpvvp2蛋白加入2×sds-page上样缓冲液(含dtt)煮沸20min后，进行sds-page和westernblot分析鉴定纯化蛋白，具体方法同1.2.3.2。

1.2.4抗bpvvp2单克隆抗体的制备

1.2.4.1动物免疫

将纯化的bpvvp2蛋白免疫6周龄spf级雌性balb/c小鼠，具体免疫程序如下：取纯化蛋白(100μg)与弗氏完全佐剂以1:1比例等体积混合乳化后，腹腔注射，间隔15天进行第二次免疫，将纯化蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，腹腔注射(剂量与第一次相同)，间隔15天后进行第三次免疫，将纯化蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后，腹腔注射(剂量与第一次相同)，第三次免疫后一周进行加强免疫，取纯化蛋白100μg(不加佐剂)腹腔注射小鼠。

1.2.4.2筛选杂交瘤细胞间接elisa方法的建立

融合前对免疫鼠和未免疫鼠分别进行眼球采血，将收集的血液37℃静置30min，然后4℃放置过夜，1000×g离心10min，吸出血清，-20℃保存备用。

采用矩阵法确定抗原、抗体的最佳工作浓度。将bpvvp2蛋白、鼠抗bpvvp2血清做不同浓度的稀释。步骤如下：

(1)抗原的稀释：将包被抗原从1:50到1:1600进行倍比稀释。

(2)包被：将稀释后的bpvvp2蛋白，分别加入elisa板中，每孔100μl，37℃包被2h。弃掉包被液，加入pbst溶液每孔200μl洗涤三次，每次5min。

(3)封闭：加入封闭液250μl，4℃封闭12h，弃掉封闭液，加入pbst溶液每孔200μl洗涤三次，每次5min。

(4)一抗：将阳性、阴性血清用含5％脱脂乳的pbs液从1：200到1:6400进行倍比稀释，加入elisa板中每孔100μl，设置平行孔，37℃孵育2h。pbst溶液每孔200μl洗涤三次，每次5min。

(5)酶标抗体：5％脱脂乳pbs缓冲液将hrp标记的山羊抗小鼠1：5000倍稀释，每孔100μl，37℃孵育1h。pbst溶液200μl洗涤三次，每次5min。

(6)显色：加入tmb底物显色液，每孔100μl，37℃避光显色5min。

(7)终止反应：加入2mh2so4终止液，每孔50μl，终止反应。

(8)读数：酶标仪读取od450nm数值。当p/n>2.0时，阳性值最接近于1.0，则判定为抗原和血清的最佳工作浓度。

1.2.4.3sp2/0细胞的准备

(1)于融合前1周复苏sp2/0细胞。将冻存的细胞从-140℃冰箱取出，并迅速放入37℃水浴融化。

(2)于10ml离心管内加入6ml基础1640培养液，将融化后的细胞液吸出，并逐滴滴加入离心管内，轻轻混匀。

(3)1000×g离心5min，弃去上清液，用完全1640培养液轻轻悬起细胞，混匀后移入细胞瓶内，于37℃培养箱培养。

(4)显微镜下观察sp2/0细胞状态，选择大小均一、边缘整齐、透光度好的细胞。将细胞用6ml基础1640培养液重悬，1000×g离心5min，弃去上清，用5ml基础1640培养液重悬细胞混匀，将细胞悬液稀释并计数。

1.2.4.4饲养层细胞的制备

(1)取未免疫的balb/c小鼠，拉颈处死，于75％酒精中浸泡5min。

(2)将小鼠固定于消毒后的解剖板上。用灭菌后的剪刀沿小鼠腹中线将腹部皮肤剪开，钝性分离皮肤与腹膜，将皮肤固定使其腹膜充分暴露。

(3)于小鼠腹腔内注射5ml预冷的hat培养液，用注射器反复吸吹培养液，然后将培养液吸出。

(4)将注射器针头取下，将吸出的培养液加入45ml预冷的hat培养液中，轻轻混匀。

(5)将培养液加入96孔板中，每孔100μl，标记时间和序号，于37℃恒温培养箱中培养。

1.2.4.5免疫鼠脾细胞的制备

(1)将免疫鼠眼球采血，用ep管收集血液，用于阳性血清的制备。

(2)拉颈处死小鼠，于75％酒精中浸泡5min。

(3)将小鼠固定于消毒后的解剖板上，用灭菌后的剪刀将小鼠皮肤沿腹中线剪开，将皮肤固定，然后剪开腹膜，将脾脏取出。

(4)将脾脏剥离结缔组织后，转移至平皿中，用注射器在脾脏下缘扎几个小孔，然后用注射器吸取5ml基础1640培养液从脾脏上缘反复吹出，直至脾脏变的透明。

(5)将含有脾细胞的培养液加入离心管中，1000×g离心5min，弃上清，再用5ml基础1640培养液重悬脾细胞，将细胞悬液进行计数。

1.2.4.6细胞融合

(1)细胞计数后，将脾细胞与sp2/0细胞按8：1的比例加入离心管中，1000×g离心10min，弃上清，用8ml基础1640培养液将细胞沉淀悬起并混匀，1000×g离心10min，弃掉上清液，重复一次。

(2)用手指轻轻弹击离心管底，使两种细胞混匀。

(3)将离心管37℃水浴，将600μl预热的细胞融合剂在1min内逐滴加入离心管，一边滴一边轻轻晃动离心管，静置90s。

(4)将预热的10ml基础1640培养液在5min内加入离心管，并轻轻混匀细胞，1000×g离心5min，弃掉上清液。用8ml基础1640培养液将细胞悬起，1000×g离心5min，弃掉上清液。

(5)将融合后的细胞用50mlhat培养液悬起，然后将细胞悬液加入到含有饲养层细胞的培养板中，每孔100μl，置于恒温培养箱培养。

1.2.4.7阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆

(1)融合后第四天观察融合后的细胞，并记录融合情况。

(2)融合一周后，用hat培养液对细胞培养板进行半换液。

(3)融合两周后，用完全1640培养液对细胞培养板进行全换液。

(4)细胞长满孔板底部1/3时，吸出100μl上清液，并加入100μl完全1640培养液。通过间接elisa方法检测细胞上清效价，阳性抗体对照为免疫小鼠血清，阴性抗体对照为未免疫小鼠血清。测od450nm值，p/n>2则结果为阳性。

(5)采用有限稀释法对检测结果为阳性的杂交瘤细胞进行克隆，克隆之后进行三次以上亚克隆，直至检测结果均为阳性。

1.2.4.8杂交瘤细胞的冻存

将杂交瘤细胞株扩大培养，由96孔板转移至24孔板，再转移到细胞瓶中扩大培养。调整细胞状态，至少10ml以上可以冻存，选取边缘整齐、形态圆润、大小均一、折光度良好且处于对数生长期的细胞，冻存之前12小时更换培养液，然后进行冻存。冻存方法如下：弃上清，取10min培养液将细胞吹下，1000×g离心10min，弃上清，用10％的dmso将细胞悬起并移入冻存管内，将冻存管放入冻存盒内冻存。

1.2.4.9单克隆抗体效价的测定

取杂交瘤细胞培养上清液，采用间接elisa方法检测单克隆抗体的效价。

1.2.5单克隆抗体生物学特性鉴定

1.2.5.1杂交瘤细胞染色体数的鉴定

染色体计数采用秋水仙素法。

1.2.5.2单抗亚类鉴定

将收集的5株杂交瘤细胞上清，用单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。具体步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.5.3杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定

将杂交瘤细胞株连续传代3个月(76代)，同时复苏冻存的杂交瘤细胞，分别收集细胞上清液，检测杂交瘤细胞上清效价。将抗体效价进行对比，确定其分泌抗体的稳定性。

1.2.5.5单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

(1)弃掉细胞培养板中的培养液，每孔加入pbs溶液(ph7.2)200μl，洗三次，每次5min。

(2)每孔加入细胞固定剂(4％多聚甲醛)200μl，室温固定30min，弃掉细胞固定剂并晾干，然后洗涤三次，方法同前。

(3)每孔加入200μl0.2％的trition-100，室温穿孔10min，然后洗涤三次，方法同前。

(4)加入0.3％bsa，37℃封闭30min，然后洗涤三次，方法同前。

(5)加入一抗，37℃作用1h，然后洗涤三次，方法同前。

(6)使用3％bsa稀释荧光二抗(避光)比例为1：500，37℃作用30min，然后洗涤三次，方法同前。

(7)荧光显微镜观察结果。

1.2.5.6单克隆抗体的特异性鉴定

通过间接elisa方法，将五株单抗分别与bpv、brv、prv、tgev和pedv反应，sp2/0上清作为阴性对照，分析五株单抗的特异性。

1.2.5.7单克隆抗体针对的抗原表位分析

利用叠加elisa方法对单克隆抗体的表位进行分析，步骤如下：

(1)包被病毒每孔200μl，37℃作用2h，pbst溶液每孔200μl洗3次，每次5min。

(2)加入一种单抗上清，37℃作用1h，pbst溶液每孔200μl洗3次，每次5min。

(3)加入另一种单抗上清，37℃作用1h，pbst溶液每孔200μl洗3次，每次5min。

(4)加入hrp标记的山羊抗小鼠igg进行1：5000倍稀释，37℃作用1h。

(5)tmb底物显色液每孔100μl，37℃显色10min，加入50μlh2so4终止显色，酶标仪读值。

(6)结果计算，ai＝(a1.2–a1)/a2×100％(a1、a2为单独单抗的od值，a1.2为叠加单抗的od值)。判定标准：ai>50％表明识别抗原位点不同，ai<50％为位点相似或相同。

1.2.6多克隆抗体的纯化与鉴定

1.2.6.1多克隆抗体的纯化

根据proteing抗体纯化使用说明书对多克隆抗体的igg进行纯化。

1.2.6.2多克隆抗体的鉴定

将纯化后的多克隆抗体与等体积的2×sds-page混合煮沸15min，之后进行sds-page鉴定。

1.2.7双抗体夹心elisa方法的建立

1.2.7.1兔抗bpvvp2多抗与mcab最佳工作浓度的确定

(1)将兔抗bpvvp2以1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200的比例稀释，每孔加入100μl，37℃包被2h。每孔加入200μpbst溶液，洗涤3次，每次5min。

(2)加入5％脱脂乳200μl每孔，37℃封闭2h。洗涤三次，方法同前。

(3)将病毒液和bt细胞上清(即阴性对照)同时加入elisa板中，设置平行孔，37℃作用2h。洗涤三次，方法同前。

(4)将单抗上清用5％脱脂乳以1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640比例稀释，加入elisa板中，每孔100μl，设置平行孔，37℃作用2h。然后洗涤三次，方法同前。

(5)加入hrp-山羊抗小鼠igg1：5000倍稀释，37℃作用1h。然后洗涤三次，方法同前。

(6)tmb底物显色液每孔100μl，37℃显色5min。

(7)加入2mh2so4终止液，每孔50μl，读取od450nm数值。当p/n>2时，od450nm值接近1，即为兔抗bpvvp2多抗和单抗的最佳工作浓度。

1.2.7.2双抗体夹心elisa方法最佳反应条件的选择

包被条件的选择：将反应板分别置于不同条件(37℃2h、37℃1h、37℃2h+4℃12h、37℃1h+4℃12h)包被，其余步骤同2.2.7.1。根据od450nm值以及p/n值确定最佳包被条件。

分别选取含2％w/vbsa、5％w/vbsa、2％w/v脱脂乳和5％w/v脱脂乳的pbs缓冲液作为封闭液，37℃封闭2h，其余步骤同1.2.7.1，根据od450nm值以及p/n值确定最佳封闭液。

封闭时间分别为：37℃60min，37℃90min，37℃120min，其余步骤同1.2.7.1，根据od450nm值以及p/n值确定最佳封闭时间。

待检样品作用时间分别为：37℃60min，37℃90min，37℃120min，37℃150min，其余步骤同1.2.7.1。根据od450nm值以及p/n值确定最佳样品反应时间。

1.2.7.3双抗体夹心elisa阳性判定标准的确定

对阴性样品进行检测，测得每份样品的od450nm值，计算样本od450nm的平均值(mean)和标准差(sd)，根据统计学原则，将平均值+3标准差设定为样本的阴、阳性的临界值。当样本的od450nm>平均值+3标准差时，可以判定为阳性。当样本的od450nm<平均值+3标准差时，则判定为阴性。

1.2.8灵敏性试验

将病毒液以1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256倍稀释，其余步骤按照上述双抗体夹心elisa方法。确定双抗体夹心elisa方法对bpv的最低检出量。

1.2.9特异性试验

选择四种病毒进行双抗体夹心elisa方法的特异性试验，分别为brv、prv、tgev和pedv。按照上述双抗体夹心elisa方法检测，bt细胞上清液作为阴性抗原对照。

1.2.10重复性试验

1.2.10.1板内重复性试验

在1块酶标板内检测5份样品，每份样品做4个重复孔。计算样品在同一块板内od450nm值的变异系数(cv)，以检验板内检测样品的重复性。

1.2.10.2板间重复性试验

选4块酶标板，检测5份样品，每份样品做4个重复孔，计算样品在不同板间od450nm值的变异系数(cv)，以检验板间检测样品的重复性。

1.2.11临床样品的检测

通过pcr方法和本研究建立的双抗体夹心elisa方法检测90份牛场收集来的牛粪样品。粪便处理方法如下：首先将粪便用pbs溶液制成悬液，反复冻融3次，1000×g离心10min，吸上清，进行检测。将pcr方法和本研究建立的双抗体夹心elisa方法检测结果进行对比。

2结果

2.1重组大肠杆菌表达载体的鉴定结果

2.1.1pcr鉴定结果

挑取转化后平板上的单菌落，提取质粒，并进行pcr鉴定，结果如图1。pcr扩增条带大小约1611bp，与目的基因vp2大小相符。

2.1.2酶切鉴定结果

将pcr鉴定结果为阳性的重组菌扩大培养后，提取质粒，将质粒进行酶切，鉴定结果如图2，双酶切后基因大小约为1611bp，与目的基因大小相符。

2.2目的蛋白的表达及纯化鉴定结果

2.2.1目的蛋白表达的sds-page鉴定结果

将重组菌pprohta-bpv-vp2/rosetta扩大培养，并进行诱导表达，经sds-page鉴定，结果如图3，表达蛋白条带大小约为60kd，与vp2目的蛋白大小相符。

2.2.2目的蛋白表达的westernblot鉴定结果

将重组菌pprohta-bpv-vp2/rosetta进行诱导表达，用his标签单抗作为一抗，进行westernblot鉴定，结果如图4，在60kd处可见特异性反应条带，与vp2目的蛋白大小相符，表明重组菌pprohta-bpv-vp2/rosseta经诱导后，vp2蛋白获得表达。

2.2.3vp2蛋白纯化后的sds-page鉴定结果

将表达的bpvvp2蛋白切胶纯化，经sds-page电泳后，结果如图5，纯化蛋白大小约为60kd，与vp2目的蛋白大小相符。经检测，纯化蛋白浓度为2.2mg/ml。

3.2.4vp2蛋白纯化后的westernblot鉴定结果

将纯化后的vp2蛋白进行westernblot鉴定，his标签单抗作为一抗，结果如图6，在60kd处可见特异性反应条带，与目的蛋白大小相符。

3.3杂交瘤细胞株筛选方法及条件的确定

将纯化后的vp2蛋白和抗血清按照表5的比例稀释，结果表明最佳抗原稀释度为1：1600，vp2蛋白最佳包被浓度为0.9μg/ml，抗血清为1：6400稀释。此时的p/n>2，od450nm值为1.028。

表5最佳抗原包被量与抗血清稀释度的确定

2.4杂交瘤细胞株的筛选和建立

融合后的细胞通过间接elisa方法筛选阳性杂交瘤细胞，共获得5株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为5g9、2b5、6a3、7e8和2b6。

2.5单克隆抗体效价的测定结果

取杂交瘤细胞培养上清，采用间接elisa方法测定单克隆抗体效价，五株杂交瘤细胞5g9、2b5、6a3、7e8和2b6分泌单抗效价分别为1：1000、1：1200、1：500、1：800、1：600，其中2b5株单抗效价最高。

2.6杂交瘤细胞生物学特性鉴定结果

2.6.1单克隆抗体亚类鉴定结果

使用单抗免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒抗体对单抗亚类进行检测，经鉴定，5g9、2b5、6a3、7e8和2b6分泌抗体亚型分别为igg2a，igg2b，igm，igm，iga。

2.6.2杂交瘤细胞的染色体计数结果

杂交瘤细胞染色体鉴定结果如图7，染色体分布均匀，且每条染色体清晰，经染色体计数杂交瘤细胞染色体数为骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞染色体数之和。

2.6.3杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定结果

将5g9、2b5、6a3、7e8和2b6连续传代3个月(76代)，使用间接elisa方法检测杂交瘤细胞冻存前后分泌抗体的效价，结果见表6，表明杂交瘤细胞可稳定分泌抗体。

表6杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定结果

2.6.4单克隆抗体反应性的鉴定结果

2.6.4.1westernblot鉴定结果

westernblot鉴定结果如图8，5株单克隆抗体(5g9、2b5、6a3、7e8和2b6)与vp2蛋白反应后，均在60kd处有特异性条带，结果表明5株单克隆抗体均可与vp2蛋白特异性结合。

2.6.4.2间接免疫荧光试验鉴定结果

将杂交瘤细胞分泌上清通过间接免疫荧光鉴定，结果如图9，5株单抗均与bpv反应，显示特异性荧光，且细胞对照组无荧光。

2.6.5单克隆抗体的特异性鉴定结果

采用间接elisa方法将单抗与brv、prv、tgev和pedv反应，结果见表7，5株单抗只与bpv发生特异性反应，与brv、prv、tgev和pedv均不发生反应。

表7单抗特异性鉴定结果

2.6.6单克隆抗体表位初步分析结果

采用叠加elisa方法对单克隆抗体表位进行初步分析。根据公式ai＝(a1.2–a1)/a2×100％计算，a1.2为两种单克隆抗体叠加的od450nm值，a1和a2为两种单克隆抗体的od450nm值，当ai>50％表明识别抗原位点不同，当ai<50％位点相似或相同。结果见表8，表明5株单抗的抗原表位都不相同。

表8单克隆抗体表位初步分析结果

注：ai＝(a1.2–a1)/a2×100％

note:ai＝(a1.2–a1)/a2×100％

2.7双抗体夹心elisa方法的建立

2.7.1多克隆抗体纯化后的鉴定结果

将兔抗bpvvp2多抗通过ge纯化柱纯化后，sds-page电泳结果如图10，可见清晰的重链和轻链条带，且无杂带，结果表明兔抗bpvvp2多抗纯化效果较好。

2.7.2多抗与单抗最佳稀释度的确定

将单抗和多抗进行倍比稀释后，检测结果见表9，最终确定多抗最佳稀释倍数为1：3200，单抗最佳稀释倍数为1：20，此时od450nm＝1.043，且p/n＞2。

表9多抗与单抗最佳稀释度的确定

2.7.3双抗体夹心elisa方法最佳反应条件的选择

2.7.3.1包被条件的选择

选取四种包被条件，分别为37℃2h、37℃1h、37℃2h+4℃过夜、37℃1h+4℃过夜，结果如图11，最终确定双抗体夹心elisa方法的最佳包被条件为37℃2h。

2.7.3.2封闭液的选择

选择封闭液分别为含有2％w/vbsa、5％w/vbsa、2％w/v脱脂乳、5％w/v脱脂乳的pbs缓冲液，结果如图12，最终确定含有5％w/v脱脂乳的pbs缓冲液封闭效果最好。

2.7.3.3封闭时间的选择

将反应板分别于37℃封闭60min、90min和120min，结果如图13，最终确定最佳封闭时间是120min。

2.7.3.4抗原孵育时间的选择

选择不同的抗原孵育时间分别为60min、90min、120min、150min，结果如图14，最终确定最佳抗原孵育时间是120min。

2.7.3.5阳性判定标准的确定

通过双抗体夹心elisa方法对阴性样品进行检测，将od450nm值根据公式计算平均值和标准差。计算最终od450值平均值＝0.091833，标准差为＝0.003430，确定阴阳性临界值＝平均值+3标准差，若样本od450nm值>0.102124时，判为阳性；od450nm值<0.102124时，判为阴性。

2.7.4特异性试验结果

通过双抗体夹心elisa方法将5株单抗分别与bpv、brv、prv、tgev和pedv反应，结果如图15，表明5株单抗只与bpv发生特异性反应，而与其它病毒(brv、prv、tgev、pedv)均不发生反应。

2.7.5灵敏性试验结果

选择效价较高的5g9、2b5分别建立双抗体夹心elisa方法，并对灵敏性进行分析，结果如表10，两种方法对病毒的最低检出量分别为6.25×10^2.8tcid50/ml和3.125×10^2.8tcid50/ml，表明基于2b5建立的双抗体夹心elisa方法的检测灵敏性更高。

另外，通过间接elisa方法(罗济冠.牛细小病毒检测试剂的制备及快速检测方法的建立[d].哈尔滨:东北农业大学硕士学位论文,2012:2-13.)检测稀释的bpv细胞培养物，对病毒的最低检测量为2.5×10⁴tcid50/ml，而本发明建立的基于2b5单抗的双抗体夹心elisa敏感性比间接elisa高出一个数量级。

表10灵敏性试验结果

2.7.6重复性试验结果

对建立的双抗体夹心elisa方法进行板内重复性试验和板间重复性试验，结果见表11和12，重复性试验的变异系数均在10％以下，表明建立的双抗体夹心elisa法具有良好的重复性。

表11板内重复性试验结果

表12板间重复性试验结果

注：s.d.表示标准差；mean表示算术平均值；cv表示变异系数，cv％＝s.d./mean

2.7.7临床样品的检测

将90份牛粪样品通过pcr方法和本研究建立的双抗体夹心elisa方法检测结果进行对比。pcr方法共检出8份阳性样品，如图16所示，目的条带大小正确。双抗体夹心elasa方法共检出8份阳性样品，结果见表13，与pcr方法检测结果相符。

表13临床样品的双抗体夹心elisa方法检测结果

实施例2检测牛细小病毒的双抗体夹心elisa试剂盒的组装

所述的试剂盒包括以下组分：

1、检测抗体：抗牛细小病毒vp2蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏号为:cgmccno.18896的杂交瘤细胞株分泌产生。

2、捕获抗体：兔抗牛细小病毒vp2蛋白多克隆抗体

3、酶标二抗：hrp标记的山羊抗小鼠igg

4、封闭液：5g脱脂乳定容于100mlpbs缓冲液(ph7.4)

5、稀释液：2.93gnahco3、1.5gna2co3、定容于1l去离子水中，ph调至9.6；

6、洗涤液：0.2gkh2po4、2.9gna2hpo4·12h2o、8.0g氯化钠、0.2gkcl、0.5mltween-20，定容于1l去离子水中，ph调至7.4；

7、显色液：tmb底物显色液

8、终止液：2mh2so4。