一株吡嘧磺隆降解菌株BI-1及其应用的制作方法

本发明涉及一株吡嘧磺隆降解菌株bi-1及其应用。

背景技术：

磺酰脲类除草剂是美国杜邦公司于20世纪70年代研发的高效、广谱除草剂，目前是第二大类除草剂，全球销售额超过23亿美元，仅次于氨基酸类除草剂。该类除草剂通过抑制植物体内乙酰乳酸合成酶(als)的活性阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成，从而达到除草效果。吡嘧磺隆是磺酰脲类除草剂的代表性品种，因其高效、单位面积用量低，且对水稻田的阔叶杂草、莎草等恶性杂草防除效果好，在我国广泛使用。但吡嘧磺隆残留半衰期长，在农田土壤中不易降解，使用不当易对后茬敏感作物如黄瓜、玉米、晚稻等多种作物产生药害。水稻直播田播后4～5d施用10％吡嘧磺隆可湿性粉剂，用量超过300g/hm²时，3d后稻株会出现生长停滞、黄化、白根少等药害症状。油菜对吡嘧磺隆敏感，油菜田误施吡嘧磺隆会造成无法挽回的药害，必须毁耕改种其他作物。吡嘧磺隆残留也会影响土壤微生物的群落结构，同时降低土壤的氧化能力。

吡嘧磺隆是磺酰脲类除草剂的代表性品种，被广泛用农田杂草的化学防除。但随着使用年限的延长与应用面积的不断增加，其在农田土壤中残留日趋严重，易造成后茬敏感作物造成药害，破坏土壤的生态环境，如何有效去除土壤中的吡嘧磺隆残留已经成为一个亟需解决的实际问题。

微生物降解是目前公认的一种环境友好、经济实惠的修复手段。近年来多种能够降解农药的微生物被人们分离筛选出来，但是吡嘧磺隆的微生物降解方面研究报道少，且菌株降解效率较低，制约了吡嘧磺隆污染环境微生物修复技术的进一步发展和应用。

技术实现要素：

本发明的一个目的是要提供一株吡嘧磺隆降解菌株bi-1及其应用，从而安全、快速地提高吡嘧磺隆降解效率。

特别地，本发明提供了一株吡嘧磺隆降解菌株bi-1，其保藏编号为cctccm2019586。

吡嘧磺隆降解菌株bi-1菌剂，是将所述的吡嘧磺隆降解菌株bi-1cctccm2019586扩大培养后得到的。

所述吡嘧磺隆降解菌株bi-1菌剂的制备方法，包括以下步骤：

s1：将bi-1菌株在r2a培养基上活化，接种于试管斜面上备用；

s2：挑取斜面上菌株接种至含r2a培养基的摇瓶中，振荡培养至对数期；

s3：投料完毕后115℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入发酵罐中，按设定发酵环境对发酵过程进行控制，发酵结束后确保菌体数量达到10亿个/ml以上；

s4：发酵完成后培养液出罐，包装瓶分装成液体剂型，得到吡嘧磺隆降解菌株bi-1菌剂。

优选的，根据制备方法，所述发酵环境为：接种后的发酵罐温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6，搅拌速度为180转/分，ph7.3，每24h补料一次，整个工艺流程培养时间为96h。

优选的，根据制备方法，r2a培养基配方为：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酪蛋白0.5，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，k2hpo40.3，mgso40.05，ph值7.2-7.5，单位为g/l。

所述的吡嘧磺隆降解菌株bi-1或所述的吡嘧磺隆降解菌株bi-1菌剂在制备吡嘧磺隆降解剂中的应用。

用于吡嘧磺隆降解菌株bi-116srrna基因序列扩增引物，其特征在于，使用下述引物进行pcr扩增：

上游引物为5′-agagtttgatcctggctcag-3′；

下游引物为5′-taccttgttacgactt-3′。

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，分离得到一株吡嘧磺隆高效降解菌株，丰富了种质资源，并开发研制出一种新型的吡嘧磺隆残留降解菌剂，使用本菌剂可以使吡嘧磺隆的残留量降低90％以上，且生产和使用成本较低，具有广阔的应用前景。

本发明公开的吡嘧磺隆降解细菌是从长期施用吡嘧磺隆农田土壤中分离得到，对吡嘧磺隆具有良好的降解效果。添加菌株bi-1至培养基中反应3d，可以完全降解50mg/l吡嘧磺隆，也是chenggangzhangella属中第一株降解吡嘧磺隆的菌株，可以为吡嘧磺隆污染土壤的修复提供理想的种质资源。

本发明提出以微生物菌株修复吡嘧磺隆污染土壤，较传统的物理化学修复而言，菌液提取过程更为迅速，田间应用见效快，可避免对环境造成二次污染，更加科学环保。

本发明公开的制备工艺流程简单，原料来源广泛，分离获取成本低，去除效果好，易于大规模推广。菌株bi-1最适生长和最适降解的温度、ph分别为30℃和7.0，对田间复杂修复环境的适应能力强，修复效果更为显著。菌株bi-1对土壤中吡嘧磺隆有降解效果、对玉米生长也有恢复作用，既解决了农业活动中吡嘧磺隆污染的问题，又能生产出绿色、无农药毒害的农产品。

根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。

附图说明

后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：

图1是为本发明中bi-1在r2a培养基上的菌落形态；

图2是本发明中bi-1的16srrna基因系统发育进化树；

图3是菌株bi-1对吡嘧磺隆降解效果的液相色谱图，a：吡嘧磺隆；b：吡嘧磺隆+bi-1；

图4是温度、ph和重金属离子对菌株bi-1降解吡嘧磺隆的影响。

具体实施方式

本发明提供一株吡嘧磺隆降解菌株bi-1，革兰氏阴性菌，严格需氧。细胞呈短杆状，无鞭毛，无运动性，不产孢子。在r2a固体培养基上，30℃培养4天后，菌落直径为1.0-2.0mm，白色，圆形，边缘光滑。菌株bi-1生长发生在15-40℃，最适温度为30℃。菌株可以在ph6.0-8.0(最适ph7.0)和0-3％nacl(最适2％)下生长。将菌株bi-1的16srdna序列在ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)中进行比对，结果表明菌株bi-1与chenggangzhangella属的亲缘关系最近，其中与chenggangzhangellamethanolivorans的16srdna相似度最高，达到99.79％，与其他属的菌株16srdna相似度不超过98％。通过neighbor-joining法构建进化树，结果表明，菌株bi-1位于chenggangzhangella属内部，并与chenggangzhangellamethanolivoranschl1^t构成了一个亚分支。结合bi-1的生理生化特征，将菌株bi-1鉴定为chenggangzhangella属的一株细菌，这是该属中第一个可以降解吡嘧磺隆的菌株。2019年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccm2019586。

实施例1

一、获得吡嘧磺隆降解菌株bi-1。

取10g长期施用吡嘧磺隆的农田土样，加入到含50mg/l吡嘧磺隆的100ml基础盐培养基中，放置在摇床中，30℃、160rpm振荡培养7d。以后每7d转接一次，取10ml培养菌液转接入新鲜的培养基中。连续转接3次后测定降解效果，吸取具有降解能力的富集液0.2ml涂布在50mg/l的吡嘧磺隆基础盐固体培养基平板上，30℃培养，待平板上出现单菌落，挑取单菌落转接至含50mg/l吡嘧磺隆的液体培养基试管中，30℃、160rpm振荡培养3d，验证单菌的降解效果。通过高效液相色谱法(hplc)测定菌株对吡嘧磺隆的降解效果，即向上述反应液中加入25％的hcl调节ph至2.0～3.0，加入等体积的二氯甲烷，剧烈旋涡震荡2min，待静置分层后去除上层水相，在有机相中加入过量无水硫酸钠以去除多余水分，取1ml有机相放入1.5ml离心管中，置于通风橱中直至溶剂完全挥发，随后用0.2ml甲醇浓缩重悬，并用0.22μm尼龙滤膜过滤后用hplc(岛津rid-10a)测定分析。高效液相色谱条件：色谱柱，c18反相柱(250mm×4.6mm×5μm,agilenttechnologies,paloalto,ca,usa)；流动相，乙腈∶水∶乙酸(60∶40∶0.5)；柱温，40℃；流速，1.0ml·min^-1；检测波长，250nm；进样量，20μl。

取降解菌株的单菌落，划线至r2a固体培养基上，30℃培养5d，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、透明度等特点。挑取在r2a固体培养基上培养5d的新鲜培养物，接种到r2a液体培养基中，30℃摇床培养48h，作为种子液。将所培养的降解菌种子液按2％(v/v)的接种量转接新鲜的r2a液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴培养，每个温度梯度设置三个平行，分别在24h和48h时测定其生长情况。按2％(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0.0％、2.0％、3.5％、5.0％、7.0％、9.0％、10.0％、11.0％和12.0％的r2a培养基，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。用无菌的1mol/lhcl和1mol/lnaoh将灭菌的r2a培养基调至ph值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，将种子液按2％接种量接入，30℃培养，分别于24h和48h的生长状态做记录。利用常规的生理生化测定方法对菌株进行鉴定。实验步骤参照说明书即可。

通过验证得到一株降解单菌，命名为bi-1。菌株bi-1是革兰氏阴性菌，严格需氧。细胞呈短杆状，无鞭毛，无运动性，不产孢子。如图1所示，在r2a固体培养基上，30℃培养4天后，菌落直径为1.0-2.0mm，白色，圆形，边缘光滑。菌株bi-1生长发生在15-40℃，最适温度为30℃。菌株可以在ph6.0-8.0(最适ph7.0)和0-3％nacl(最适2％)下生长。菌株的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶，酯酶(c4)，酯酶脂肪酶(c8)，亮氨酸芳基酰胺酶，缬氨酸芳基酰胺酶，半胱氨酸芳基酰胺酶，胰蛋白酶，酸性磷酸酶，脲酶反应阳性，萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、n-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶和β-岩藻糖苷酶反应呈阴性。h2s生成，吐温20和吐温60的水解反应呈阴性，吐温40水解呈阳性。菌株可以利用d-葡萄糖酸，葡糖醛酸，d-葡萄糖酸、d-苹果酸生长。

实施例2

二、提取菌株bi-1的基因组dna、进行pcr扩增并确定属种

本发明采用高盐法进行菌株bi-1基因组dna的提取：将菌株bi-1在r2a固体平板上划线培养活化菌株，置于30℃下培养5d，挑取单菌落至r2a液体培养基中，于30℃，160rpm下培养至对数期；12000rpm离心5min收集菌体至2ml的无菌离心管中，加入1.0mlte缓冲液洗涤bi-1菌体，待菌体被洗涤至无培养基残留后再加入1.0mlte缓冲液将菌体重新悬浮；加入溶菌酶至终浓度为20mg/ml，在37℃下温浴2h后加入8μl蛋白酶k(20mg/ml)和50μl10％sds，65℃水浴2h，使其澄清(或37℃过夜至澄清)；加入三分之一体积的饱和nacl溶液充分震荡混匀15s，65℃水浴10min，12000rpm离心10min，小心地将上清液转移到洁净无菌的离心管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25:24:1)进行抽提至界面无蛋白为止，收集上清；再将上清液转移到另外一个洁净无菌的离心管中，加入3/5倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀使其沉淀；将沉淀的dna用洁净的毛细管挑出后用70％乙醇洗涤干净，置于超净台风口处使乙醇完全挥发；最后用50μl的无菌水将dna溶解，于-20℃冰箱保存。

bi-116srrna基因序列(1451bp)

gagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgcatccttcggggtgagcggcagacgggtgagtaacgcgtggggatgtgcctggtggtacggaacaactcatggaaacgtgagctaataccgtataagcccttttggggaaagatttatcgccaccagatcaacccgcgttggattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttcactggggaagataatgacggtacccagagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatactaagggggctagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgcacgtaggcggagtcttaagtcagaggtgaaatcccaaggctcaaccttggaactgcctttgatactgggtgtcttgaggtcgagagaggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctcactggctcgattctgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattacctgataccctggtagtccacgccgtaaacgatggaagctagccgttggtcagcatgctgatcagtggcgcagctaacgctttaagcttcccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcctttgacatcctgtgccactcagagagatttgaggttcccttcggggacgcagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccctagttgccagcattcagttgggcactctagggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggcagcgaaggggtgacccggagctaatctccagaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgttgcgctaacccgcaagggaggcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgta

用于16srrna基因序列扩增反应的引物为一对通用引物。上游引物为5′-agagtttgatcctggctcag-3′，下游引物为5′-taccttgttacgactt-3′。pcr反应体系为50μl，包括10×buffer5μl，dntp(20mmol/l)4μl，引物(25pmol/μl)各1μl，mg²⁺(25mmol/l)4μl，菌体dna(约50ng/μl)1μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.3μl，加超纯水至50μl。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃，延伸1min；30个循环，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5kb左右)，采用pcr回收试剂盒回收16srrna基因片段，t/a克隆后进行测序。测序结果通过在线分析(www.ezbiocloud.net)，与genbank中的16srrna基因序列进行相似性比较，构建系统进化树。

以菌株bi-1的总dna为模板，16srrna基因通用引物进行pcr扩增，得到总长为1451bp的bi-116srrna基因序列。将该序列在ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)中进行比对，结果表明菌株bi-1与chenggangzhangella属的亲缘关系最近，其中与chenggangzhangellamethanolivorans的16srrna基因序列相似度最高，达到99.79％，与其他属的菌株16srrna基因序列相似度不超过98％。如图2所示，通过neighbor-joining法构建菌株bi-1的系统进化树表明，菌株bi-1位于chenggangzhangella属进化树内部，并与chenggangzhangellamethanolivoranschl1^t构成了一个亚分支，结合bi-1的生理生化特征，将菌株bi-1鉴定为chenggangzhangella属的一株细菌。

本发明的菌株bi-1，已于2019年7月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：cctccm2019586。该菌株的分类命名是chenggangzhangellasp.bi-1。

实施例3

三、确定温度、ph、金属离子对菌株bi-1降解吡嘧磺隆的影响

1、温度对菌株bi-1降解吡嘧磺隆的影响：

在50mg/l吡嘧磺隆的基础盐液体培养基中，以2％体积比的接种量接入菌株bi-1的种子液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，160rpm培养3d后检测吡嘧磺隆的浓度，计算降解率。

2、ph对菌株bi-1降解吡嘧磺隆的影响：

调节基础盐液体培养基的ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，另外添加50mg/l吡嘧磺隆。以2％体积比的接种量添加菌株bi-1的种子液，30℃，160rpm培养3d后检测吡嘧磺隆的浓度，计算降解率。

3、金属离子对菌株bi-1降解吡嘧磺隆的影响：

将菌株bi-1种子液按2％体积比接种量接种到装有100ml基础盐液体培养基中，吡嘧磺隆的浓度为50mg/l。培养基中分别加入1mmol/l重金属离子ag⁺、ni²⁺、cd²⁺、zn²⁺，30℃、160rpm培养3d后测定吡嘧磺隆的浓度，计算降解率。

如图3所示，在实验室条件下，添加菌株bi-1至培养基中反应3d，可以完全降解50mg/l吡嘧磺隆，也是chenggangzhangella属中第一株降解吡嘧磺隆的菌株，可以为吡嘧磺隆污染土壤的修复提供理想的种质资源。由图4所示可知，温度为30℃，ph为7.0以及无重金属离子添加的培养基中，吡嘧磺隆的降解率最高。在添加ag⁺、cd²⁺、zn²⁺、ni²⁺的培养基中，吡嘧磺隆的降解率分别为9.8％、7.8％、9.6％和53.4％，表明重金属离子ag⁺、cd²⁺、zn²⁺、ni²⁺对菌株的降解具有不同程度的抑制作用。

实施例4

四、获得吡嘧磺隆降解菌株bi-1菌剂

将菌株在r2a培养基上活化，接种于试管斜面上备用。挑取斜面上菌株接种至含200mlr2a培养基的1000ml摇瓶中，振荡培养至对数期，准备接种发酵罐。发酵罐500升，投料量400升，培养基配方为(g/l)：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酪蛋白0.5，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，k2hpo40.3，mgso40.05，ph值7.2-7.5。投料完毕后115℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入发酵罐中，接种后的发酵罐温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6，搅拌速度为180转/分，ph7.3，每24h补料一次，整个工艺流程培养时间为96h，发酵结束后确保菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐，包装瓶分装成液体剂型。

实施例5

五、吡嘧磺隆降解菌株bi-1及其菌剂在土壤中的作用

取20目过筛后的自然风干菜地土壤450g(未检测到吡嘧磺隆)至盆钵中，加入吡嘧磺隆至3mg/kg，搅拌均匀，喷施水使其含水量达到饱和含水量的60％，接种上述所制菌剂，接种量为0.01ml/g，搅拌均匀，另设仅添加菌剂与仅添加吡嘧磺隆的处理，未进行处理的样品作为空白对照，并将玉米幼苗移栽至不同处理的盆钵中，每个处理设置4个平行。置于人工气候培养箱(gxz型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂，gxz-500d)中以30℃，12h光照和20℃，12h黑暗为一周期，培养20d。测定土壤中吡嘧磺隆的浓度以及玉米茎叶长、根长、茎叶鲜重和根系鲜重。

土壤中吡嘧磺隆浓度的测定：收集土壤样品，称取5g置于50ml离心管中，加入10ml的萃取液(pbs∶乙腈＝8∶2)，150rpm，1h，4000g离心15min，收集上清液，沉淀用10ml萃取液重悬，重复上述操作3次，合并上清液，用hcl调节ph至2.5，cleanerthxn固相萃取柱用来纯化萃取液，具体操作见说明书。洗脱液用n2吹干，1ml甲醇重悬，并用0.22μm的尼龙膜过滤，液相检测。液相色谱条件：液相色谱仪型号为岛津rid-10a；液相色谱柱为c18反相柱，规格为250mm×4.6mm×5μm；流动相为乙腈∶水∶乙酸(60∶40∶0.5)；柱温为40℃；流速1.0ml·min^-1；检测波长为250nm。通过外标法制作吡嘧磺隆的标准曲线，比较样品目的峰与标准品的峰面积，定量检测吡嘧磺隆的浓度。

表1菌株bi-1对土壤中吡嘧磺隆的降解及药害的修复效果(20天)

注：对照：未添加菌株bi-1和吡嘧磺隆；bi-1：仅添加菌株bi-1；吡嘧磺隆：仅添加吡嘧磺隆；吡嘧磺隆+bi-1：添加吡嘧磺隆与菌株bi-1。不同字母代表在p<0.05水平差异显著(邓肯检验)

吡嘧磺隆是一种高效除草剂，少量残留即可造成敏感作物严重的药害。本实验以敏感作物玉米为指示作物，测定菌株bi-1对土壤中吡嘧磺隆的降解效果及其对玉米生长的恢复作用。结果如表1所示，玉米的茎叶长、根长、茎叶鲜重与根鲜重会因为吡嘧磺隆的添加而显著下降，抑制率分别为75.97％、80.35％、82.88％和91.13％，表明吡嘧磺隆对玉米的生长有明显的影响。当土壤中仅接种菌株bi-1，玉米生长的各项指标与对照没有显著差异，表明菌株bi-1对玉米生长没有影响。当吡嘧磺隆污染土壤中接种菌株bi-1，玉米的生长得到明显的恢复。同时测定不同处理下土壤中吡嘧磺隆的浓度，结果表明仅添加3mg/kg吡嘧磺隆处理的土壤，20d后土壤中吡嘧磺隆的浓度仍可达到2.18mg/kg，而添加了吡嘧磺隆和bi-1菌悬液的处理，20d后土壤中已经检测不到吡嘧磺隆的存在。

同时对菌株bi-1降解菌剂对水体中吡嘧磺隆的降解效果进行测定：取500ml吡嘧磺隆生产工厂废水，初步过滤后，添加吡嘧磺隆至终浓度为3mg/l，加入制备的bi-1降解菌剂，使其终浓度为10⁸个细胞/毫升水，以添加相同体积无菌水的水体作为对照，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，3天后取样测定吡嘧磺隆在水体中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算平均降解率。结果表明，添加bi-1菌剂处理的样品中已经检测不到吡嘧磺隆，未添加的处理，吡嘧磺隆没有被降解，表明bi-1降解菌剂也能有效降解水体中吡嘧磺隆的残留。

本发明分离得筛选得到一株高效降解吡嘧磺隆的细菌菌种，丰富了微生物的种质资源，降解效率高且性状稳定，并提供降解菌剂的制备方法，可以有效降解土壤和水体中吡嘧磺隆的残留，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适用于吡嘧磺隆污染环境的修复，本发明对于保护生态环境，保护人体的身体健康具有重要的意义。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

序列表

<110>南阳师范学院

<120>一株吡嘧磺隆降解菌株bi-1及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1451

<212>rrna

<213>吡嘧磺隆降解菌株bi-116srrna基因序列()

<400>1