一种RNA抑制剂及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种rna抑制剂及其应用。

背景技术：

脊髓损伤（spinalcordinjury，sci）是一种严重的中枢神经损伤性疾病，涉及到全世界数以百万计的患者，他们的生活和工作质量均受到严重影响。据统计，只有不到1％的sci患者能够完全恢复神经功能，大部分患者需要长时间的住院治疗，康复治疗，以及需要全职或兼职看护人员，使他们往往无法正常工作，给家庭和社会带来沉重的负担，然而国内外对sci的药物治疗和外科手术治疗均未取得令人满意的临床疗效。因此，研究sci的机制及治疗具有极其重要的意义。星形胶质细胞是中枢神经系统（centralnervoussystem，cns）中数量最多、最丰富的细胞。sci后星形胶质细胞可以转换为活化表型，被称为反应性星形胶质细胞，反应性星形胶质细胞的特征在于细胞胞体增大，中间丝蛋白如胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，gfap）和巢蛋白(nestin)的表达增加，反应性星形胶质细胞在急性损伤部位愈合和组织重塑过程中是必需的，它们最终会与其他细胞类型如成纤维细胞或其他神经胶质细胞相互作用，形成胶质瘢痕。同时，反应性星形胶质细胞分泌抑制性细胞外基质分子，如硫酸软骨素蛋白多糖（cspgs），抑制轴突生长和再生。胶质瘢痕的形成阻碍轴突再生和功能恢复，被认为是哺乳动物cns中再生能力差的主要原因。研究证明mirna在脊髓发生、生长及正常活动中发挥着调节作用，已显示mirna能够参与sci后继发性损伤，神经再生及神经可塑性等调节作用。sci后失调mirnas的潜在靶点包括编码参与炎症、氧化和凋亡的基因，这些基因在脊髓损伤的发病机制中起着重要作用，提示mirnas的异常表达可能与脊髓损伤的发病机制有关。mir-17是mir-17-92簇成员之一，除了在促进肿瘤的发生中起作用外，基因芯片结果显示sci后mir-17是发生异常变化的mirna之一。寻找在脊髓损伤后影响星形胶质细胞活化的关键mirna可作为脊髓损伤治疗的有效靶点，具有重要的医学意义和深远的社会意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种rna抑制剂及其应用，证明应用mirna-17-5p抑制剂可减轻脊髓损伤后星形胶质细胞活化和繁殖，具有重要的医学意义和深远的社会意义。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种rna抑制剂，为mirna-17-5p抑制剂，具有mirna-17-5p抑制序列。

其中，所述mirna-17-5p抑制序列为：

5’-3”cuaccugcacuguaagcacuuug。

本发明还提供一种rna抑制剂在抑制脊髓损伤后星形胶质细胞的活化和增殖中的应用。

本发明还提供一种应用上述的rna抑制剂减轻脊髓损伤后星形胶质细胞活化的方法，包括如下步骤：

（1）首先给予mirna-17-5p抑制序列，制得mirna-17-5p抑制剂；

（2）收集由少突胶质细胞分泌的外泌体；

（3）将收集的外泌体与损伤后的星形胶质细胞共孵育，实现星形胶质细胞摄取外泌体，减轻损伤的星形胶质细胞的过度活化。

其中，步骤（3）的具体操作方法为：将星形胶质细胞以2×10³个/孔接种在预先用多聚赖氨酸包被的96孔板中，置于37℃5%co2培养箱中培养48h，细胞进入对数生长期后，吸出培养基，加入antago-control-exo外泌体和antagomir-17-exo外泌体，每组6个复孔孵育48h后，吸出培养基，每孔加100ul混合液，在37℃恒温摇床孵育4小时，使用酶标仪测定450nm波长的吸光值。

进一步，antago-control-exo为oln-93细胞加入mir-17-5p抑制剂对照后提取外泌体；antagomir-17-exo为oln-93细胞加入mir-17-5p抑制剂后提取外泌体。

其中，所述混合液由基陪和cck-8溶液以体积比9:1混合而成。

其中，步骤（1）中mirna-17-5p抑制序列为：

5’-3”cuaccugcacuguaagcacuuug。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明证明应用mirna-17-5p抑制剂可减轻脊髓损伤后星形胶质细胞活化和繁殖，具有重要的医学意义和深远的社会意义。

附图说明

图1为本发明中少突胶质细胞分泌的外泌体可以被星形胶质细胞摄取的示意图；

图2为本发明中cck-8检测星形胶质细胞的细胞活力的结果图；

图3为本发明中脊髓损伤后mir-17-5p表达量上调的示意图；

图4为本发明中免疫荧光结合原位杂交技术检测脊髓损伤后mir-17-5p的细胞定位示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

脊髓损伤后星形胶质细胞的过度活化是形成胶质瘢痕的主要原因，可抑制轴突生长和再生，是阻碍脊髓损伤后修复的重要因素。脊髓损伤后少突胶质细胞产生大量携带mir-17-5p的外泌体。

以大鼠脊髓撞击伤模型进行相关检测。fastblue检测脊髓损伤后的组织形态的变化（图3a），qpcr检测脊髓损伤后mir-17-5p的表达变化，结果显示损伤后mir-17-5p表达逐渐上调（图3b），原位杂交检测损伤后mir-17-5p的表达，结果显示损伤后mir-17-5p表达逐渐上调（图3c）。

图4所示为免疫荧光结合原位杂交技术检测脊髓损伤后mir-17-5p的细胞定位示意图。图4中，spl：脊髓损伤后的脊髓组织水平检测；ol：原代培养的少突胶质细胞中检测mir-17-5p。

携带mir-17-5p的外泌体可由星形胶质细胞摄取，进而促进星形胶质细胞活化。如图1所示为少突胶质细胞分泌的外泌体可以被星形胶质细胞摄取的示意图，将cm-dil标记的oln-93分泌的外泌体与星形胶质细胞37℃共孵育24h，通过荧光显微镜观察分析，绿色为星形胶质细胞特异性标记物gfap，发现实验组红色标记oln-93-exo主要存在于胞浆。图1中bar=50μm。

实施例1

本发明提供了一种rna抑制剂，为mirna-17-5p抑制剂，具有mirna-17-5p抑制序列。

所述mirna-17-5p抑制序列为：

5’-3”cuaccugcacuguaagcacuuug。

实施例2

本发明提供了一种mirna-17-5p抑制剂在抑制脊髓损伤后星形胶质细胞的活化和繁殖中的应用。

一种应用mirna-17-5p抑制剂减轻脊髓损伤后星形胶质细胞活化的方法，包括如下步骤：

（1）首先给予mirna-17-5p抑制序列，制得mirna-17-5p抑制剂；

mirna-17-5p抑制序列为：

5’-3”cuaccugcacuguaagcacuuug。

（2）收集由少突胶质细胞分泌的外泌体；

（3）将收集的外泌体与损伤后的星形胶质细胞共孵育，实现星形胶质细胞摄取外泌体，减轻损伤的星形胶质细胞的过度活化；具体操作方法为：将星形胶质细胞以2×10³个/孔接种在预先用多聚赖氨酸包被的96孔板中，置于37℃5%co2培养箱中培养48h，细胞进入对数生长期后，吸出培养基，加入antago-control-exo外泌体（antago-control-exo为oln-93细胞加入mir-17-5p抑制剂对照后提取外泌体）和antagomir-17-exo外泌体（antagomir-17-exo为oln-93细胞加入mir-17-5p抑制剂后提取外泌体），每组6个复孔孵育48h后，吸出培养基，每孔加100ul混合液（90ul基陪和10ulcck-8溶液），在37℃恒温摇床孵育4小时，使用酶标仪测定450nm波长的吸光值，利用cck-8检测星形胶质细胞的细胞活力，结果如图2所示，mir-17-5p抑制剂预处理后提取损伤的少突胶质细胞分泌的外泌体，作用于星形胶质细胞可减轻损伤的星形胶质细胞的过度活化。

本发明应用脊髓损伤后少突胶质细胞产生大量携带mir-17-5p的外泌体，且可由星形胶质细胞摄取，进而促进星形胶质细胞活化的特性，设计了mir-17-5p的拮抗剂，实现减轻星形胶质细胞过度增殖的目的，为脊髓损伤的治疗提供有效治疗靶点。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南通大学

<120>一种rna抑制剂及其应用

<141>2019-12-16

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>rna

<213>mirna

<400>1

cuaccugcacuguaagcacuuug23