一种长链非编码RNAlnc-PMIF及其小干扰RNA和应用的制作方法

本发明属于分子生物学及医学技术领域，具体涉及一种长链非编码rnalnc-pmif及其小干扰rna和应用。

背景技术：

非编码rna(non-codingrna)是指不编码蛋白质的rna。其中包括microrna(mirna)和长链非编码rna(longnon-codingrna,简称lncrna)等。这些rna的共同特点是都能从基因组上转录，但是不编码蛋白，在rna水平上行使各自的生物学功能。其中lncrna是一种长大于200nt的真核内源型rna，广泛分布于真核生物体内，在细胞分化、器官发育和疾病发生等多种生理和病理过程中起重要的调控作用。而成骨细胞是骨形成的主要功能细胞。随着人年龄的增长，骨的发育也发生着动态的变化，其中由成骨细胞引导的骨形成和由破骨细胞引导的骨吸收构成了骨重建的动态平衡。当成骨细胞分化异常时，会导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质增生、骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯等。

1ncrna可在细胞分化，个体发育和疾病中发挥重要作用，如lnc-dc可以调控神经树突状细胞分化，lncrna-digit可以调控胚胎内胚层形成，lncrna-clmat1可以诱导结直肠癌肝转移等；这些研究主要集中于神经、发育、肿瘤等领域，有关lncrna参与骨质疏松症等骨代谢疾病的研究报道较少。

纽约大学西奈山医学院的dflee等人在李-佛美尼综合症(lfs)患者ipsc来源的成骨细胞中，发现lncrnah19的表达降低，经进一步分析发现，在恢复成骨细胞中h19的表达后，能促进成骨细胞的分化，同时抑制骨肉瘤的成瘤能力。提示了lncrna可以对成骨细胞分化发挥作用，也说明可以利用lncrna来作为治疗骨质疏松等骨骼系统疾病的药物。但该研究仅局限于李-佛美尼综合症患者ipsc来源的成骨细胞中，未做对于正常非病理现象(如衰老，绝经，长期卧床等)情况下的成骨细胞研究(leedf,etal.modelingfamilialcancerwithinducedpluripotentstemcells,cell.2015apr9；161(2):240-254)。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种长链非编码rnalnc-pmif。本发明通过lncrna高通量测序、cdna末端快速扩增技术(rapidamplificationofcdnaends，race)和克隆测序，发现和鉴定了一条lncrna，命名为lnc-pmif，设计lnc-pmif的引物，检测lnc-pmif在老龄小鼠骨质疏松模型、去卵巢骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达，证明其表达与骨质疏松症的发生具有相关性。再通过设计小干扰rna序列验证lnc-pmif的功能，证明lnc-pmif可以通过hur抑制成骨细胞迁移。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种长链非编码rnalnc-pmif，其特征在于，所述长链非编码rna的cdna序列如seqidno：1所示，或者所述长链非编码rna的cdna的序列为与seqidno：1所示序列杂交的核苷酸序列。

上述的一种长链非编码rnalnc-pmif，其特征在于，用于检测所述长链非编码rna的引物序列如下：

lnc-pmif-1-forward，其核苷酸序列如seqidno：2；

lnc-pmif-1-reverse，其核苷酸序列如seqidno：3；

lnc-pmif-1-probe，其核苷酸序列如seqidno：4；

lnc-pmif-2-forward，其核苷酸序列如seqidno：5；

lnc-pmif-2-reverse，其核苷酸序列如seqidno：6。

另外，本发明还提供了一种上述长链非编码rnalnc-pmif在制备或筛选诊断人骨骼系统疾病的产品中的应用。

上述的应用，其特征在于，所述人骨骼系统疾病包括骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性病变或脊柱侧弯。

上述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片、试剂或试剂盒。

进一步地，本发明提供了一种如上述长链非编码rnalnc-pmif的小干扰rna，其特征在于，所述小干扰rna的正义链序列如seqidno：7，小干扰rna的反义链序列如seqidno：8。

进一步地，本发明提供了一种上述长链非编码rnalnc-pmif的小干扰rna在制备治疗人骨骼系统疾病药物或药物组合物中的应用。

上述的应用，其特征在于，所述人骨骼系统疾病包括骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性病变或脊柱侧弯。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过lncrna高通量测序、cdna末端快速扩增技术(race)和克隆测序，发现和鉴定了一条lncrna，命名为lnc-pmif，设计lnc-pmif的引物，检测lnc-pmif在老龄小鼠骨质疏松模型、去卵巢骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达，证明其表达与骨质疏松症的发生具有相关性。

2、本发明通过设计小干扰rna序列，验证lnc-pmif的功能，证明lnc-pmif可以通过hur抑制成骨细胞迁移，lnc-pmif序列可用于骨骼系统疾病的诊断或作为治疗靶点；设计的小干扰rna序列可用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是本发明实施例1利用illumina测序技术平台检测lncrna在老龄骨质疏松小鼠模型和去卵巢骨质疏松小鼠模型骨形成细胞中表达的结果heatmap图。

图2是本发明实施例2利用race技术从小鼠来源的mc3t3-e1细胞系中调取rna进行race实验的产物电泳图。

图3是本发明实施例3利用qpcr技术检测长链非编码rnalnc-pmif在老龄骨质疏松小鼠模型和去卵巢骨质疏松小鼠模型骨形成细胞中的表达水平的结果图。

图4是本发明实施例4的干扰序列对照组和转染lnc-pmif的小干扰rna序列的转染干扰序列组的成骨细胞中lnc-pmif的表达水平的结果图。

图5是本发明实施例5的干扰序列对照组和转染lnc-pmif的小干扰rna序列的转染干扰序列组的细胞迁移相关基因actin和mmp-2的表达水平的结果图。

图6是本发明实施例6的干扰序列对照组和转染lnc-pmif的小干扰rna序列的转染干扰序列组的划痕实验和transwell实验检测结果图。

图7是本发明实施例7应用lnc-pmif和hur进行rnapulldown-ms和rip实验结果图。

图8是本发明实施例8应用lnc-pmif的小干扰rna序列通过尾静脉注射转染c57/bl6小鼠的骨形成结果图。

图9是本发明实施例9应用lnc-pmif的小干扰rna序列通过尾静脉注射转染c57/bl6小鼠的骨微结构结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。

实施例1

利用illumina测序技术平台检测lncrna在老龄骨质疏松小鼠模型和去卵巢骨质疏松小鼠模型骨形成细胞中表达的结果heatmap图；表明了增龄过程中骨形成细胞中lncrna的表达差异情况。

(1)建立老龄骨质疏松小鼠模型：

选用c57bl/6实验小鼠，饲养至6月龄(对照组)、18月龄(老龄组)。

(2)处死小鼠，收集股骨、胫骨，分离骨髓，将骨髓置于成骨细胞条件培养基中，于5％co2条件下37℃培养。

(3)从细胞中用trizol法提取总rna，分光光度计检测样品纯度(a260/a280)；

(4)安捷伦2100rnanano6000assaykit(agilenttechnologies,ca,usa)检测rna样品的完整性和浓度；

(5)每个样品取3μg总rna作为起始量，用ribo-zero^tmgoldkits去除样品中的核糖体rna(rrna)，根据nebnextultradirectionalrnalibraryprepkitforillumina(neb，ispawich，usa)操作说明分别选取不同的index标签，构建lncrna文库；

(6)基于illumina测序技术平台，利用双末端测序(pe150)的方法，构建去除核糖体rna的链特异性文库(插入片段为350bp)测序，获得lncrna测序数据，每个样品产生不低于12gb的cleandata。

结果见图1。从图中可以看出，lnc-rna在老龄骨质疏松小鼠成骨细胞中的表达量与年轻小鼠成骨细胞中的表达量存在明显差异，lnc-rna显著上调，说明lnc-rna在骨组织中的表达量与骨质疏松相关。

实施例2

lnc-pmif全长cdna序列信息的获得：

本实施例提供了长链非编码rnalnc-pmif全长cdna序列的获得方法，具体包括以下步骤：

步骤一、采用trizol法从小鼠来源的mc3t3-e1细胞系中提取总rna，去除样品中的核糖体rna(rrna)，基于illumina测序技术平台，利用双末端测序法构建链特异性文库测序，获得lncrna序列数据；

步骤二、根据测序得到的lncrna序列信息，设计3’race和3’race引物如下；

表1race引物

步骤三、用race试剂盒3'-fullracecoresetwithprimescript^tmrtase(takara)和5'-fullracekitwithtap(takara)分别进行3’race和5’race，获得race产物；

步骤四、将上述race产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图2，证明lnc-pmif在骨形成细胞中存在)，切胶回收不同大小的cdna条带；

步骤五、将回收的cdna通过t-a克隆法连接到测序载体pgem-t上中进行测序，获得长链非编码rnalnc-pmif的全长cdna序列，如序列表中seqidno：1所示，lnc-pmif长度为1.5kb。

实施例3

利用qpcr技术检测发现，lnc-pmif在老龄骨质疏松小鼠模型和去卵巢(ovx)骨质疏松小鼠模型的骨形成细胞样品中高表达。

(1)设计并制备lnc-pmif的特异性引物，序列见表2；

(2)建立老龄骨质疏松小鼠模型：

选用c57bl/6实验小鼠，饲养至6月龄(对照组)、18月龄(老龄组)，处死小鼠，收集股骨和骨髓细胞样本。

(3)建立ovx骨质疏松小鼠模型：

选用c57bl/6实验雌性小鼠，麻醉后于腰部剃毛为手术区，分别于背中线两侧开口0.5厘米并用镊子找到卵巢和子宫角，游离卵巢并摘除，缝合、消毒，对照组只切除卵巢周围与卵巢大小相当的一块脂肪组织。实验期间动物自由进食、饮水，3个月后处死小鼠，收集股骨和骨髓细胞样本。

(4)提取小鼠骨组织样本rna：

取骨组织样品，无菌条件下将骨髓细胞用27g1/2注射器冲出，2000rpm离心5分钟，弃去上清，细胞于成骨细胞条件培养基中培养，每5天半换液，28天后收取细胞。将细胞转移到1.5mlep管，加入1mltrizol(invitrogen公司)，之后震荡仪混匀。4℃，12000g离心20min。取上清，转移到新的1.5mlep管。每1mltrizol加入200μl的氯仿，用手上下震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000g离心15min。取出ep管，样品分为三层，将上层的水相转移到新的1.5mlep管中。加入4℃预冷的异丙醇(500μl/1mltrizol)，轻轻吹打混匀，沉淀rna。-20℃冰箱静置30min，沉淀rna。4℃，12000g离心10min。去除上清，缓慢沿管壁加入1ml75％乙醇，小心地吹打混匀。4℃，7500g离心10min。去除上清，室温干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入50μlrnase-free的水，吹打混匀，溶解rna。(可放置在-80℃冰箱保存)用紫外分光光度计检测rna在260nm和280nm处的吸光值。根据a260/a280比值检测所得rna的纯度，纯rna的a260/a280比值在2.0左右(一般实验中，这一比值最好控制在1.7以上，2.1以下)。电泳，凝胶成像仪上观察结果：28s条带与18s条带之比应接近2:1，5s条带不亮。

(5)利用qpcr技术检测lnc-pmif在老龄骨质疏松小鼠骨组织样本中的表达变化：

使用takara反转录试剂盒，先将提取的rna反转录为cdna。反转录条件为：37℃15min；85℃15s。取各组的cdna为模板，以gapdh为内参，采用qpcr检测lnc-pmif基因在老龄骨质疏松小鼠成骨细胞中的表达量。qpcr反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s，44个循环。所用lnc-pmif与gapdh引物序列如下：

表2qpcr引物序列

结果见图3(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*p<0.05，***p<0.001)，从图中可以看出，lnc-pmif在老龄骨质疏松小鼠成骨细胞中高表达，说明lnc-pmif在骨组织中的表达量与骨质疏松相关。

实施例4

lnc-pmif的rna干扰序列可有效抑制lnc-pmif在前成骨细胞mc3t3-e1中的表达。

(1)制备lnc-pmif的小干扰rna序列：

根据lnc-pmif的核苷酸序列合成寡核苷酸单链以及互补的双链，经高效液相色谱法纯化，并进行前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记，最终获得lnc-pmif的小rna干扰序列si-lnc-pmif。接着，合成阴性对照干扰序列。使用rnasefree水将合成的寡核苷酸稀释为20μm的存储液，分装后于-80℃冻存。lnc-pmif的小干扰rna序列如下：

表3lnc-pmif的小干扰rna序列

(2)用lnc-pmif的小干扰rna序列转染前成骨细胞mc3t3-e1：

实验分组：转染干扰序列组：转染lnc-pmifsirna；干扰序列对照组：转染sirna-nc。每孔的配置，取前成骨细胞mc3t3-e1，以1×10⁶/孔的细胞数接种于6孔板中，2ml含10％fbs、100μg/ml链霉素与100μg/ml青霉素10％fbs，1％l-谷氨酰胺的α-mem细胞培养基；24小时内细胞汇合达到70-90％；在250μl的α-mem无血清培养基加入20pmolsirna5ul柔和混匀；用250μl无血清的α-mem稀释5μllipofectamin2000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的sirna和lipofectamin2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成sirna/lipofectamin复合物；将500μl复合物加到含有细胞的培养板孔内，补加1.5ml的α-mem无血清培养基，来回轻柔摇晃细胞培养板。将细胞在co2培养箱中37℃孵育6小时后，更换培养基，继续孵育。待48h后，进行转染后的其它检测步骤。

(3)提取转染后mc3t3-e1细胞的rna：

在含有转染细胞的培养板每孔中加入trizol(invitrogen公司)，待细胞充分裂解后，转移到新的1.5mlep管，其余提取步骤同上。

(4)qpcr检测lnc-pmif表达量(步骤同上)，所用lnc-pmif与gapdh引物序列同表2所示。

结果见图4(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***p<0.001)。从图中可以看出，在转染了小干扰rna序列后，lnc-pmif的表达水平明显下降。说明本发明设计制备的lnc-pmif的小干扰rna序列可有效抑制lnc-pmif在前成骨细胞mc3t3-e1中的表达。

实施例5

lnc-pmif的小干扰rna序列可有效促进前成骨细胞中细胞迁移相关基因actin和mmp-2的表达水平。

转染及rna提取参照实施例4，接着取各组的cdna为模板，以gapdh作为内参，采用qpcr检测细胞迁移相关基因actin和mmp-2的表达。所用actin、mmp-2引物序列如下：

表4细胞迁移相关基因引物序列

结果见图5(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*p<0.05，***p<0.001)，从图中可以看出，在前成骨细胞中，当lnc-pmif的表达量下降时，其细胞迁移相关基因的表达量升高，说明本发明的小干扰rna序列可有效促进细胞迁移相关基因actin和mmp-2的表达，可促进成骨细胞迁移。

实施例6

lnc-pmif的小干扰rna序列可有效促进前成骨细胞迁移。

(1)划痕实验：

实验分组：转染干扰序列组：转染lnc-pmifsirna；干扰序列对照组：转染sirna-nc。转染参照实施例4。取处理后的前成骨细胞mc3t3-e1，以5×10⁵/孔的细胞数接种于6孔板中(用记号笔提前在孔背后画好直线)，每组设3个复孔，过夜后用枪头比着直尺垂至于背后的横线划痕。用pbs洗涤3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5％co2培养箱，培养。在第0和18小时拍照，计算划痕的宽度。

(2)transwell实验：

取sirna处理的前成骨细胞mc3t3-e1，用pbs小心地冲洗细胞以彻底去除血清，将培养基更换为无血清培养基，进行细胞饥饿18h。将饥饿后的细胞进行消化，加入无血清培养基，吹打混匀，离心800rpm，5min；弃上清，细胞沉淀加入无血清培养基吹打混匀，计数。取出transwellchamber放入24孔板中，先加下室培养基(α-mem含10％fbs)700μl，chamber中加入200μl细胞悬液(0.6×10⁵)，另一组下室加无血清培养基。将transwellchamber放置到24孔板的相应位置，防止chamber底部有气泡，否则将影响实验结果。37℃孵箱12小时后，分别取出进行后续0.1％结晶紫染色观察。

结果见图6，从图中可以看出，在前成骨细胞中，当lnc-pmif的表达量下降时，其细胞迁移能力升高，转染lnc-pmif的小干扰rna序列可有效提高成骨细胞迁移的距离和数目，说明lnc-pmif的小干扰rna序列可抑制成骨细胞迁移，提示lnc-pmif可作为诊断和治疗骨质疏松等骨骼系统相关疾病药物作用的靶点。

实施例7

lnc-pmif可以特异性结合hur。

(1)生物信息学验证

通过rpiseq预测分析工具(http://pridb.gdcb.iastate.edu/rpiseq/)，预测得到的lnc-pmif与hur的结合评分为0.90；通过catrapid在线预测网站(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)，预测结合位点如下：

表5通过catrapid预测得到的lnc-pmif与hur的结合位点

(2)rnapulldown：

将lnc-pmif基因克隆到载体pgem-t(promega公司)载体上，用生物素进行标记(biotinrnalabelingmix，roche公司)作为探针，用rna探针在mc3t3-e1细胞的细胞裂解液中钓取与lnc-pmif有相互作用的蛋白，用hur抗体(abcam公司，ab200342，1:1000)和lamina/c抗体(博士德公司，ba1227，1:400)进行westernblot检测。

(3)rip：mc3t3-e1细胞用加入了蛋白酶抑制剂(碧云天公司)和rna酶抑制剂(takara公司)的蛋白裂解液(100mmofkcl,5mmofmgcl2,10mmofhepes[ph7.0],0.5％np-40,and1mmof二硫苏糖醇)冰上裂解30分钟，12,000g离心15分钟。将上清与proteina/g磁珠混合，再分别与hur抗体(abcam公司，ab200342，1:1000)和igg蛋白(碧云天公司)在4℃孵育过夜。将proteina/g磁珠复合物用磁力架分离。常规trizol法抽提rna，进行qpcr检测(引物序列见表1和表3)。

(4)qpcr检测actin的表达(以gapdh为内参)：实验分组：转染干扰序列组：转染lnc-pmifsirna；干扰序列对照组：转染sirna-nc。

结果见图7(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，证明lnc-pmif对成骨细胞迁移的调节机制，即通过结合hur抑制成骨细胞迁移。说明lnc-pmif可以特异性结合hur，lnc-pmif的小干扰rna序列可以促进actin表达。

实施例8

lnc-pmif的小干扰rna序列可有效促进骨形成。

(1)建立老龄骨质疏松小鼠模型：

选用c57bl/6实验小鼠，饲养至18月龄。

(2)将上述老龄骨质疏松小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射干扰序列对照和干扰序列，剂量均为10mg/kg体重)，2周注射1次，连续4次；于最后一次注射两周后处死；分别于处死前倒数第十天和倒数第二天给每只鼠注射钙黄绿素溶液，剂量为20mg/kg体重；处死小鼠，收集股骨，置于10％福尔马林溶液中保存。

(3)将股骨进行冰冻切片，荧光显微镜下拍摄骨形成线，见图8(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*p<0.05)。

从图8中可以看出，本发明设计的lnc-pmif小干扰rna序列可以有效促进骨形成。

实施例9

lnc-pmif干扰序列可有效改善骨微结构。

(1)建立老龄骨质疏松小鼠模型：

选用c57bl/6实验小鼠，饲养至18月龄。

(2)将上述老龄骨质疏松小鼠随机分为两组，分别尾静脉注射干扰序列对照和干扰序列，剂量均为10mg/kg体重)，2周注射1次，连续4次；于最后一次注射两周后处死；分别于处死前倒数第十天和倒数第二天给每只鼠注射钙黄绿素溶液，剂量为20mg/kg体重；处死小鼠，收集股骨，置于10％福尔马林溶液中保存。

(3)将股骨进行显微ct扫描与成像，分析其骨体积/组织体积(bv/tv)指标，见图9(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，**p<0.01)。

从图9可以看出，本发明设计的lnc-pmif的小干扰rna序列可以有效改善骨微结构。

本发明通过lncrna高通量测序、cdna末端快速扩增技术(rapidamplificationofcdnaends，race)和克隆测序，发现和鉴定了一条lncrna，命名为lnc-pmif，设计lnc-pmif的引物，检测lnc-pmif在老龄小鼠骨质疏松模型、去卵巢骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达，证明其表达与骨质疏松症的发生具有相关性。再通过设计小干扰rna序列验证lnc-pmif的功能，证明lnc-pmif可以通过hur抑制成骨细胞迁移。本发明的lnc-pmif序列可用于骨骼系统疾病的诊断或作为治疗靶点；设计的小干扰rna序列可用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110>西北工业大学

西安九清生物科技有限公司

<120>一种长链非编码rnalnc-pmif及其小干扰rna和应用

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1455

<212>dna

<213>musmusculus

<400>1

caggtgtggctgttagccctggagcgtcagcggaagctgaatgatgccttggacagactg60

gaggagttgaaagaatttgccaactttgactttgatgtctggaggaaaaagtatatgcgt120

tggatgaatcataaaaaatctcgagtcatggatttcttccggcgtattgacaaggaccag180

gatgggaagataacacgtcaggagtttatcgatggcattttagcatctaagttcccaacc240

accaagttagagatgacagctgtggccgacatttttgacagagatggggatggctacatt300

gactactatgaatttgtggctgccttacatcccaacaaggatgcctatcggccaacaact360

gatgcagataagattgaagatgaggtcacaagacaagtggctcagtgcaagtgtgcaaaa420

agattccaagtggaacagattggagagaataaataccgggtaaggaagagaaaagccaac480

catttgtggaggtcattgcctccggggtcatcctgacacacagcagagcagctcatgctg540

cctgttccctcctgctgcctccagaggcccagaacccaggccttcatccctaggtgtcaa600

gtttcatgccctgtgtagttccatctgaaaagctaccattattacccaggtagactgtag660

cttatagttgacatggtagaaaatatttcatagccctcatctcactgctgagcaaaacct720

taggtgcctttagaaacagttttattaaaggacttgtgaagcagagtctgagattcttcc780

tgtaatcccagaacttgggaggcaaaggcagaagcagaagcaccattgcaagttcaagac840

caactctacatagtgagtcgcagctaaccaaggccatatcacaaaaatgtctcagatatt900

tttaaaaagcatggatcaggatgctgggaatggttcagtatataaaggtgcttgccacca960

agcctgacaacctgagttcaagtcctaaaggggaaacacgcaccccaaaattgtcctctg1020

gtgtgtttgtgcacatatacattttcttttttgttgttgttgttttgttttttgggcttt1080

ttgttctgttttaatttttttccattaaaaaaaaagagtgatggttcatccacaagaact1140

ggtcattgtgagcctactggctcccatgctaatagaagacgatgtgtgaaagcccccaac1200

acatagctagtgttgctgtgctgagttaggctacaactggaacctacatgccctggagag1260

ccgggctcagtgatcttccctggaaagacttgttgggtataatcagaagtaacaggaaac1320

tatgcttaaatgttagcatctcttaggactagagtcagggatgtagtagagacataaacc1380

aggactcctatatgcatcagcttgtcaagggaccctgaaattttaaggaaaaaaaaaaac1440

aacaaaaaaaaaaaa1455

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gatgctgggaatggttcagtatat24

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgcacaaacacaccagagga20

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tgccaccaagcctgacaacctgag24

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttcctggtaaccctgtaac19

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gctgatatagcaagtcaagt20

<210>7

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ccuuaggugccuuuagaaatt21

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

uuucuaaaggcaccuaaggtt21

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tgcaccaccaactgcttag19

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

ggatgcagggatgatgttc19

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

caggtgtggctgttagccct20

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

taccgtcgttccactagtgattt23

<210>13

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tgatgccttggacagact18

<210>14

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

cgcggatcttccactagtgatttcactatagg32

<210>15

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cctgtgctgctcaccgagg19

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

tgaagctgtagccacgctcg20

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ccttcactttcctgggcaaca21

<210>18

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

atggcatggccgaactcat19