一种湖北麦冬内生米曲霉菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种湖北麦冬内生米曲霉菌菌株及其应用。

背景技术：

湖北麦冬，来源于百合科植物湖北麦冬liriopespicatavar.proliferay.t.ma的干燥块根，收载于《中国药典2015年版》，因主产于湖北省襄阳市，行业内俗称为“襄麦冬”。湖北麦冬具有养阴生津、润肺清心的功效。湖北麦冬多糖作为湖北麦冬的主要活性成分之一，具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等方面的药理作用，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。

目前获取湖北麦冬多糖的方法主要还是通过直接分离湖北麦冬块根提取物获得。由于在湖北麦冬实际种植生产中，存在着诸如“受连作障碍导致种植面积相对较小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“多糖提取成本高”等因素，从而导致湖北麦冬多糖的产量受到限制，进而影响到湖北麦冬多糖的市场投放率。因此，亟需找到一种干扰因素少、产量稳定的湖北麦冬多糖制备方法。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提出一种湖北麦冬内生米曲霉菌菌株及其应用，旨在从湖北麦冬中分离出一种米曲霉内生菌，该米曲霉内生菌通过微生物发酵可以稳定且大量地生产湖北麦冬多糖。

为实现上述目的，本发明利用产自湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬gap基地生产的湖北麦冬，从其活体块根中分离纯化得到一株米曲霉属的湖北麦冬内生菌(aspergillusoryzaestrainef024)。本发明分离纯化得到的湖北麦冬内生米曲霉菌菌株已经在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为米曲霉菌(aspergillusoryzaestrain)ef024，保藏编号为cctccno.m2018779，保藏时间为2018年11月12日。

本发明还提出了一种湖北麦冬内生米曲霉菌菌株的分离纯化方法。湖北麦冬内生米曲霉菌菌株的分离纯化方法包括以下步骤：

取清洗干净的新鲜湖北麦冬植物块根，进行表面无菌消毒处理；

将消毒后的麦冬块根切成组织小片，置于pda培养基中，密封后于28℃下恒温培养5～7天，直至所述组织小片长出菌丝并形成多个颜色、形状均不相同的菌落；

挑取黄绿色、蓬松状、平铺在培养皿中的菌落的菌丝尖端，转移至新鲜的pda培养基中多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即为米曲霉菌ef024。

其中，pda培养基中含有氨卞青霉素且氨卞青霉素在pda培养基中的终浓度为50ug/ml。

米曲霉菌ef024在pda培养基上为黄绿色、蓬松、平铺的菌落。

为了了解米曲霉菌ef024的遗传背景，对其进行基因组测序，其18srrna基因序列，如seqidno.1所示。

将测序结果于ncbi网站进行序列比对，发现其序列与aspergillusoryzaerib40，xr_002735719.1的序列同源性最高，相似性达到99％。

本发明还提出一种如上所述的湖北麦冬内生米曲霉菌菌株在制备湖北麦冬多糖上的应用。

米曲霉菌ef024可自身代谢产生湖北麦冬多糖。因此，通过微生物发酵即可“快速化”、“工厂化”地大量生产湖北麦冬多糖。用米曲霉菌ef024制备湖北麦冬多糖的方法包括以下步骤：

取米曲霉菌ef024接种于pda培养基，28℃下活化培养72h；

将活化后的菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm下培养72h，得种子液；

按照10％的接种量，将种子液接种于马铃薯液体培养基中，28℃、180rpm下培养7天，得发酵固液混合物；

将发酵固液混合物冷冻干燥后粉碎成粉末，用95％乙醇洗涤、烘干，得干粉；

将干粉热水浸提后，透析浓缩成浸膏，经醇沉处理，获得沉淀物；

依次用无水乙醇、丙酮、乙醚对沉淀物进行洗涤，干燥后获得湖北麦冬多糖。

其中，马铃薯液体培养基的配方为200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

本发明技术方案中，通过对产自湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬gap基地生产的新鲜湖北麦冬植物块根进行分离纯化，得到米曲霉菌ef024，该菌株可自身代谢产生湖北麦冬多糖。由于液体发酵的方式受外界环境的干扰较小，且发酵生产的产率较高，本发明通过对米曲霉菌ef024进行液体发酵，即可快速且大量地生产湖北麦冬多糖，而且，相较传统的化学提取工艺，液体发酵工艺对环境的污染小，使得湖北麦冬多糖的生产更加环保。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提出的湖北麦冬内生米曲霉菌菌株形成的菌落图；

图2为实施例4的hplc鉴别中阳性对照的色谱图；

图3为实施例4的hplc鉴别中菌产多糖样品液的色谱图；

图4为实施例3获得的菌产多糖对四种自由基的清除活性对比图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前获取湖北麦冬多糖的方法主要还是通过直接分离湖北麦冬块根提取物获得。由于在湖北麦冬实际种植生产中，存在着诸如“受连作障碍导致种植面积相对较小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“多糖提取成本高”等因素，从而导致湖北麦冬多糖的产量受到限制，进而影响到湖北麦冬多糖的市场投放率。因此，亟需找到一种干扰因素少、产量稳定的湖北麦冬多糖制备方法。

鉴于此，本发明利用产自湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬gap基地生产的湖北麦冬，从其活体块根中分离纯化得到一株米曲霉属的湖北麦冬内生菌(aspergillusoryzaestrainef024)。本发明分离纯化得到的湖北麦冬内生米曲霉菌菌株已经在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为米曲霉菌(aspergillusoryzaestrain)ef024，保藏编号为cctccno.m2018779，保藏时间为2018年11月12日。

如图1所示，由本发明实施例中米曲霉菌(aspergillusoryzaestrain)ef024在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上的形态图可看出，米曲霉菌(aspergillusoryzaestrain)ef024呈黄绿色，蓬松状平铺在培养皿。

本发明实施例中米曲霉菌(aspergillusoryzaestrain)ef024的18srrna基因序列，如seqidno.1所示。将测序结果于ncbi网站进行序列比对，发现其序列与aspergillusoryzaerib40，xr_002735719.1，同源性达到99％。

本发明提出一种湖北麦冬内生米曲霉菌菌株的分离纯化方法。湖北麦冬内生米曲霉菌菌株的分离纯化方法包括以下步骤：

步骤s10、取清洗干净的新鲜湖北麦冬植物块根，进行表面无菌消毒处理。

实施时，可以采用乙醇和次氯酸钠溶液浸泡、漂洗来进行消毒。具体地，先用水清洗湖北麦冬块根表面的泥土，然后用纯化水超声清洗；除去湖北麦冬块根表面附着的水分后，依次用75％(v/v)乙醇浸泡块根、有效氯含量位4～6％的次氯酸钠溶液浸泡、漂洗，再用无菌滤纸蘸干水分。其中，更换浸泡液时可以用无菌水反复漂洗以去除残留的浸泡液。

步骤s20、将消毒后的麦冬块根切成组织小片，置于pda培养基中，密封后于28℃下恒温培养5～7天，直至所述组织小片长出菌丝并形成多个颜色、形状均不相同的菌落。

其中，组织小片宜切割得越薄越好，以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分。此外，本步骤中采用的pda培养基含有氨卞青霉素且氨卞青霉素在pda培养基中的终浓度为50ug/ml。

步骤s30、挑取黄绿色、蓬松状、平铺在培养皿中的菌落的菌丝尖端，转移至新鲜的pda培养基中多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即为米曲霉菌ef024。

实际操作时，可以通过采用分子生物学技术对获得的单一纯菌落进行分子鉴定，鉴定结果表明，该纯菌落即为米曲霉菌ef024。

米曲霉菌ef024可自身代谢产生湖北麦冬多糖。基于此，本发明还提出了一种如上所述的湖北麦冬内生米曲霉菌菌株在制备湖北麦冬多糖上的应用。通过微生物发酵即可规避湖北麦冬药材种植生产中的各种不利因素，从而“快速化”、“工厂化”地大量生产湖北麦冬多糖。

用米曲霉菌ef024制备湖北麦冬多糖的方法包括以下步骤：

步骤s100、取米曲霉菌ef024接种于pda培养基，28℃下活化培养72h；

步骤s200、将活化后的菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm下培养72h，得种子液；

步骤s300、按照10％的接种量，将种子液接种于马铃薯液体培养基中，28℃、180rpm下培养7天，得发酵固液混合物；

其中，马铃薯液体培养基的配方为200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。

步骤s400、将发酵固液混合物冷冻干燥后粉碎成粉末，用95％乙醇洗涤、烘干，得干粉；

步骤s500、将干粉热水浸提后，透析浓缩成浸膏，经醇沉处理，获得沉淀物；

步骤s600、依次用无水乙醇、丙酮、乙醚对沉淀物进行洗涤，干燥后获得湖北麦冬多糖。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1菌株的分离

(1)样品取自湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬gap基地生产的湖北麦冬。采集湖北麦冬块根后，使用大量水清洗附着在湖北麦冬块根表面的泥土，然后将块根放入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；

(2)用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75％(v/v)乙醇浸泡块根2min后，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量位4～6％的次氯酸钠溶液浸泡块根2min后，用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分；

(3)取经步骤(2)消毒处理后的湖北麦冬块根样品，在无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成0.5cm×0.5cm组织小片，组织小片优选薄片；将组织小片置于培养皿中的pda培养基(含有氨卞青霉素且氨卞青霉素在pda培养基中的终浓度为50ug/ml)上，用镊子均匀地轻压组织小片，使其紧紧贴服于平板上，每培养皿中植入2片组织小片，并设五组培养皿做重复试验，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

(4)每天观察样品真菌生长的情况，5～7天后组织小片的周缘长出菌丝，从而在培养皿上形成了一个个颜色、形状均不相同的菌落，挑取黄绿色、蓬松状、平铺在培养皿中的菌落的菌丝尖端转移到新的pda培养基上进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，经分子生物学技术鉴定，该纯菌落为米曲霉菌ef024。

实施例2菌株的鉴别

(1)将实施例1分离得到的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上28℃培养形成菌落，观察菌落形态、颜色等特征。结果如图1所示，菌落呈黄绿色，且多个菌落呈蓬松状平铺在培养皿中。

(2)对实施例1分离得到的菌株进行基因组测序，其18srrna基因序列如seqidno.1所示。

将测序结果于ncbi网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)进行序列比对，发现其序列与aspergillusoryzaerib40，xr_002735719.1的序列同源性最高，相似性达到99％。说明实施例1分离得到的菌株为米曲霉属的真菌。

实施例3菌株的发酵

(1)取实施例1分离得到的米曲霉菌ef024菌种。在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的pda培养基试管中，于28℃活化培养72小时；

(2)在无菌条件下，取活化培养后的菌株接种于已灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)中，28℃、180rpm振荡培养72小时，得种子液；

(3)将200g土豆、20g葡萄糖、1000ml蒸馏水配制成液体发酵培养基，取100ml液体发酵培养基装入250ml的三角瓶中，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量，将种子液接种于马铃薯液体培养基中，28℃、180rpm下培养7天，得发酵固液混合物；

(4)将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，然后将其研成粉末，重复三次加入100ml95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干，得干粉；

(5)按比例1∶10(g/ml)，向干粉中加蒸馏水，于80℃下水浴2h后过滤，再次按比例1∶10(g/ml)向滤渣中加蒸馏水，于80℃下水浴2h后过滤，然后合并两次过滤后的滤液并进行离心，取上清液透析48h，获得浓缩液，将浓缩液减压浓缩成浸膏，再用100ml95％乙醇对其进行醇沉，收集沉淀物；

(6)将沉淀物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，获得菌株发酵液多糖提取物，4℃保存待用。

实施例4菌产多糖的鉴定

(1)颜色反应鉴定

萘酚-浓硫酸反应鉴别方法：取200ul样品溶于400ul15％的1-萘酚中，加入浓硫酸100ul，若溶液颜色呈蓝紫色，则结果为阳性；

蒽酮-浓硫酸反应鉴别方法：取400ul样品，加入300ul蒽酮硫酸溶液，若溶液颜色呈蓝绿色，则结果为阳性。

采用萘酚-浓硫酸反应鉴别方法和蒽酮-浓硫酸反应鉴别方法分别对实施例3获得的发酵产物进行检测。

结果：两种检测方法的反应结果均呈阳性，说明实施例3获得的发酵产物中确实含有多糖。

实施例3获得的菌产多糖的酸解液：取20mg实施例3获得的发酵产物，加入5ml纯水进行溶解，再加入0.25ml的12mol/lhcl，于120～126℃环境中反应4h；取反应液中和、透析后，稀释至10ml，即为酸解液。

(2)tlc鉴别

在颜色反应鉴定的基础上，以湖北麦冬多糖的酸解产物为阳性对照，对实施例3获得的菌产多糖的酸解液进行薄层层析。

薄层层析的参数为：

展开剂为正丁醇：无水乙醇：冰醋酸：纯水＝2:3:1:1(v/v/v/v)；

显色剂为称取4g二苯胺、量取4ml苯胺及20ml85％磷酸溶于200ml丙酮；

显色方法：将薄层板置于105℃烘箱中加热3min，直至显出清晰红色斑点为止。

结果：实施例3获得的菌产多糖的酸解液与阳性对照具有相似的rf值，说明实施例3获得的菌产多糖中含有的多糖为湖北麦冬多糖。

(3)hplc鉴别

菌产多糖样品液：取实施例3获得的菌产多糖的酸解液1ml置于离心管中，加1ml0.5mol/mlpmp-甲醇溶液及1ml0.3mol/lnaoh溶液，涡旋1min后，70℃水浴60min，然后冷却至室温。加入1ml0.3mol/lhcl溶液中和，再用氯仿2ml进行萃取，萃取3次并合并水层，然后用水系滤膜过滤，备用。使用前需超声0.5h。

以湖北麦冬多糖的酸解产物为阳性对照。

使用色谱仪岛津lc-20高效液相色谱仪(检测器：spd-m20a，柱温箱：cto-20a并配真空脱气机dgu-20a3，色谱柱inertsustainc18)进行鉴别试验。

设置色谱条件为：

利用乙腈：磷酸盐缓冲溶液(ph5.0)＝20:80进行等度洗脱，设置流速1ml/min；光谱数据采集通道：ch1(250nm)；进样量10μl；记录30min数据；信号强度单位为mau。

结果：如图2和图3所示，图中，横坐标为保留时间，纵坐标为响应值。从图2中可以看出样品保留时间与对照一致，说明实施例3获得的发酵产物中含有的多糖为湖北麦冬多糖。

实施例5菌株菌产多糖的性能检测

采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、dpph法和abts法，分别测试实施例3获得的菌产多糖对oh、o2^-、dpph、abts自由基的清除活性。结果如图4所示。

从图4中可以看出，实施例3获得的菌产多糖对四种自由基(dpph、o2^-、oh、abts)均具有一定的体外清除活性，且抗氧化能力与浓度呈正相关。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

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<110>湖北文理学院

<120>湖北麦冬内生米曲霉菌菌株及其应用

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