灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法与流程

本发明实施例涉及菌种应用技术领域，具体涉及灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法。

背景技术：

目前具有抗肿瘤作用的灵芝多糖主要从子实体中提取，但子实体的生产受自然环境因素影响较大，影响了灵芝多糖的开发生产；而采用液体深层发酵具有周期短、工艺简单、成本低、产量大、适于工厂化生产等显著优点，该方法大大提高了灵芝多糖的生产能力。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法，用以解决现有灵芝多糖生产能力低下的问题。

为实现上述目的，本发明实施例主要提供如下技术方案：灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法，所述选取供试灵芝菌株为黑灵芝和紫灵芝，将各灵芝菌株接种于pda培养基上，25℃培养10d，4℃保藏，菌种的制备方法包括以下几个步骤：步骤一：菌种活化，是从保存的母种试管中切出0.5cm大小的菌丝块接种于斜面培养基的中部，培养7d后，再转接1次，于25℃培养7d后待用；

步骤二：将液体培养，首先是种子液的制备，取1em大小的活化菌种2～3块于基础培养基中，置于25℃旋转式摇床上180r/min振荡培养7d；然后进行液体培养，取长满菌球的猴头菌液体菌种，按5％的接种量接人各组试验培养基中，在25℃旋转式摇床上180r/rain振荡培养7d；

步骤三：发酵罐培养，发酵罐培养基采用正交试验优选最佳产多糖培养基，起始ph5.5，压力0.4x10pa，温度25℃，180r/min，接种紫灵芝液体菌种，接种量10％，空气流量为2-5l/min。

优选的，所述正交试验优选最佳摇瓶培养基,以发酵液中胞外粗多糖的含量为评价指标，初筛摇瓶培养基中的氮源、碳源、金属离子含量和灭菌前ph为因素，采用正交试验l9(34)434)对其优化，从而筛选液体深层发酵最佳培养基。

优选的，所述使用经标准缓冲液标定过的ph计于室温条件下测定ph。

优选的，所述筛选培养基分别摇瓶培养供试的灵芝菌株，测定发酵滤液体积、菌丝体干重和胞内胞外粗多糖量。

优选的，所述以0.2％的豆饼粉氮源、2％的蔗糖为碳源，分别添加不同的化合物，观察不同金属离子对多糖产量的影响。

本发明实施例提供的技术方案至少具有如下优点：使用时先利用特制的化学杀菌剂在密闭容器中将常规饮用水处理为无菌水，然后按照一定比例在无菌条件下倒入一定量的浓缩菌种稀释后即可接种，制备液体的菌种将复杂严格的液体发酵过程转化为固体培养过程，更加简单可靠，对设备要求也大幅降低。同时匀浆后的浓缩菌种体积小，冷藏条件下可以长途运输，利于集中制种。

附图说明

图1为本发明实施例提供的流程框图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、接口、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。在其它情况中，省略对众所周知的系统、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本发明的描述。

实施例1

请参阅图1，本发明提供的灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法的技术方案：灵芝体提取原菌种转化液体生产菌种的方法，所述选取供试灵芝菌株为黑灵芝和紫灵芝，将各灵芝菌株接种于pda培养基上，25℃培养10d，4℃保藏，菌种的制备方法包括以下几个步骤：步骤一：菌种活化，是从保存的母种试管中切出0.5cm大小的菌丝块接种于斜面培养基的中部，培养7d后，再转接1次，于25℃培养7d后待用；

步骤二：将液体培养，首先是种子液的制备，取1em大小的活化菌种2～3块于基础培养基中，置于25℃旋转式摇床上180r/min振荡培养7d；然后进行液体培养，取长满菌球的猴头菌液体菌种，按5％的接种量接人各组试验培养基中，在25℃旋转式摇床上180r/rain振荡培养7d；

步骤三：发酵罐培养，发酵罐培养基采用正交试验优选最佳产多糖培养基，起始ph5.5，压力0.4x10pa，温度25℃，180r/min，接种紫灵芝液体菌种，接种量10％，空气流量为2-5l/min。

优选的，所述正交试验优选最佳摇瓶培养基,以发酵液中胞外粗多糖的含量为评价指标，初筛摇瓶培养基中的氮源、碳源、金属离子含量和灭菌前ph为因素，采用正交试验l9(34)434)对其优化，从而筛选液体深层发酵最佳培养基。

优选的，所述使用经标准缓冲液标定过的ph计于室温条件下测定ph。

优选的，所述筛选培养基分别摇瓶培养供试的灵芝菌株，测定发酵滤液体积、菌丝体干重和胞内胞外粗多糖量。

优选的，所述以0.2％的豆饼粉氮源、2％的蔗糖为碳源，分别添加不同的化合物，观察不同金属离子对多糖产量的影响。

综上所述：菌种的培养基筛选有多种筛选试验，摇瓶培养基筛选试验，氮源筛选试验，以1.1.2的基础培养基为基础，分别以0.2％的蛋白胨、豆饼粉、麸皮、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵和谷氨酸替换其中的酵母粉，研究不同氮源对多糖产量的影响，每次筛选后的结果进入随后的培养基不同条件筛选试验，每个试验重复3次。

碳源筛选试验，以1.1.2的基础培养基为基础，用0.2％豆饼粉替换酵母粉，再分别以2％的果糖、蔗糖、乳糖、淀粉和麦芽糖替换其中的葡萄糖，研究不同碳源对多糖产量的影响。

金属离子筛选试验，以1.1.2的基础培养基为基础，分别以2％的蔗糖和0.2％的豆饼粉为碳源和氮源，分别添加0.2％的，kh2po4、cac12、mgso4·7h2o、feso4和znc12，研究不同金属离子对多糖产量的影响。

胞外多糖的提取采用乙醇沉淀法，将发酵液于3000r/rain离心20min分离，用与发酵液同体积的蒸馏水洗涤，继续离心分离20min，合并上清液，旋转蒸发后浓缩至发酵液体积的1/2，用3倍浓缩液体积的95％乙醇醇析，然后离心20rain，再用与浓缩液同体积的95％乙醇醇析，再离心20min便得到胞外粗多糖，60摄氏度烘干至恒重，即为胞外粗多糖重量。

茵丝体于重取100ml培养液，1000×g离心20min，沉淀以蒸馏水反复洗涤后，105℃烘至恒重，称量、记录菌丝体干重。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的技术方案的基础之上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。