本发明涉及具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法。
背景技术：
沙棘（hippophaerhamnoidesl.），又名醋柳、黄酸刺、黑刺、酸刺，胡颓子科、沙棘属的落叶灌木或乔木，为药食两用植物。沙棘起源于青藏高原，因其极强的生态适应性，在亚欧大陆的温带、寒温带以及亚热带高原山区有广泛分布。我国是沙棘资源量最大的国家，在三北地区大量栽培，共有沙棘林140万公顷，占世界沙棘总面积的95%。沙棘籽粕为沙棘籽经萃取油脂后的固体废料，但籽粕中仍含有大量蛋白质，可作蛋白质提取原料，而我国沙棘行业每年产生约26.3万吨籽粕，对这部分生物资源的高值化利用具有良好的市场前景和生态价值。
目前，从沙棘籽粕中制备蛋白的方法有醇洗法、碱提酸沉法、酶解法、水提法等，并具备了较为成熟的产业基础，但主要集中在于沙棘籽粕的可溶性蛋白，而对沙棘籽粕醇提渣中的非可溶性蛋白几乎没有关注。因此，本发明以沙棘籽粕作为原料，采用醇提预处理、酶解-碱提联用法提取蛋白、双缩脲比色法测定蛋白含量并计算得率，提供了一种沙棘籽粕非可溶性蛋白的高效制备方法，并提供了其在抗氧化活性产品中的应用。
技术实现要素：
本发明提供了一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法，主要步骤包括：
（1）沙棘籽粕粉碎，备用；
（2）沙棘籽粕醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用；
（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、碱性水溶液按比例充分混匀，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕非可溶性蛋白。
进一步地，如步骤（3）所述，沙棘醇提渣：碱性水溶液液料比为30:1~50:1，优选地料液比为44:1。
进一步地，如步骤（3）所述，蛋白酶添加量为0.5%~1.5%，优选地蛋白酶添加量为1.4%。
进一步地，如步骤（3）所述，碱性水溶液ph为12.0~13.0，优选地碱性水溶液ph为12.3。
进一步地，如步骤（3）所述，蛋白酶为糜蛋白酶或胰蛋白酶，优选地为胰蛋白酶。
进一步地，如步骤（3）所述，碱性水溶液溶质为氢氧化钠、氢氧化钾、三乙胺，优选地溶质为氢氧化钠或/和三乙胺。
进一步地，沙棘籽粕非可溶性蛋白提取得率高达41.69%~50.53%。
进一步地，沙棘籽粕非可溶性蛋白具有良好的抗氧化能力，清除自由基能力达到50.4%~73.6%。
蛋白质含量测定：
采用中华人民共和国农业行业标准nyt1678-2008《乳与乳制品中蛋白质的测定双缩脲比色法》，取18支试管分成3组，每组6支，依次加入10mg/ml酪蛋白标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，用水补至1.0ml，各管分别加入双缩脲试剂4.0ml，充分混合均匀，室温（20~25℃）静置30min，540nm波长下测定吸光值，以酪蛋白标准品含量为横坐标，a540nm为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=0.0391x+0.0016，r=0.9990，x为酪蛋白浓度(mg/ml),y为540nm波长时的吸光值，线性范围：2.0~10.0mg/ml；样品测定：取1.0ml待测液，加4.0ml双缩脲试剂，方法同上，以测得样品在540nm的吸光度值代入上述回归方程，按下式计算蛋白提取得率：
蛋白提取得率=[上清液中蛋白含量（g）/沙棘籽粕质量（g）]×100%。
抗氧化能力测定
参考w.brand-williams,m.e.cuvelier,c.berset,useofafreeradicalmethodtoevaluateantioxidantactivity,lwt-foodscienceandtechnology,volume28,issue1,1995,pages25-30提供的方法适应性修改后测定抗氧化能力，具体方法如下：（1）dpph乙醇溶液配制，精确称取2.5mgdpph，避光充分溶解于50ml无水乙醇中，dpph溶液浓度为0.05mg/ml，备用，（2）样品溶液的配制，样品用乙醇配制成100mg/ml储备液，稀释200倍，得到浓度为500μg/ml待测溶液待测抗氧化能力；（3）试验步骤，先在96孔板中分别加入受试样品10μl，空白孔加入等量无水乙醇，每个样品浓度6孔重复，分组标记，每孔加入190μldpph乙醇溶液，室温避光反应30min，在波长517nm处测定各孔吸光度值，按下式计算dpph清除率，抗氧化能力以对自由基dpph的清除率表示：
清除率（%）=（a0-a1）/（ac0-ac1）*100%；式中：a0：样品孔0min吸光值；a1：样品孔30min吸光值；ac0：空白对照孔；0min吸光值；ac1：空白对照孔30min吸光值。
总体来说，本发明首次以沙棘籽粕醇提渣为原料，创新性地采用酶解-碱提联用法，制备了沙棘籽粕蛋白，且其具有良好的抗氧化活性。
本发明提供的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法与现有技术相比具有以下优势：
（1）本发明将醇提作为沙棘籽粕非可溶性蛋白制备的除杂步骤，并首次发现沙棘籽粕醇提渣中具有含量丰富的非可溶性蛋白质；
（2）本发明创新性地采用酶解-碱提联用法，将沙棘籽粕醇提渣中的非可溶性蛋白质制备纯化，并且非可溶性蛋白质提取得率高达41.69%~50.53%；
（3）本发明制备得到的沙棘籽粕非可溶性蛋白具有良好的抗氧化活性，清除自由基能力达到50.4%~73.6%。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
具体实施方式
实施例1：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:44、蛋白酶添加量为1.4%、氢氧化钠水溶液ph为12.3，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白a。经试验测定，沙棘籽粕蛋白a的提取得率为50.53%，抗氧化能力为73.6%。
实施例2：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:30、蛋白酶添加量为1.0%、氢氧化钠水溶液ph为13.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白b。经试验测定，沙棘籽粕蛋白b的提取得率为41.69%，抗氧化能力为50.4%。
实施例3：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:50、蛋白酶添加量为0.5%、氢氧化钠水溶液ph为12.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白c。经试验测定，沙棘籽粕蛋白c的提取得率为42.98%，抗氧化能力为53.6%。
实施例4：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:50、蛋白酶添加量为1.5%、氢氧化钠水溶液ph为12.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白d。经试验测定，沙棘籽粕蛋白d的提取得率为48.72%，抗氧化能力为65.3%。
对比实施例1：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:30、蛋白酶添加量为1.0%、氢氧化钠水溶液ph为11.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白e。经试验测定，沙棘籽粕蛋白e的提取得率为15.69%，抗氧化能力为10.4%。
对比实施例2：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:50、蛋白酶添加量为1.0%、氢氧化钠水溶液ph为11.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白f。经试验测定，沙棘籽粕蛋白f的提取得率为23.58%，抗氧化能力为13.7%。
对比实施例3：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:40、蛋白酶添加量为0.5%、氢氧化钠水溶液ph为11.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白g。经试验测定，沙棘籽粕蛋白g的提取得率为19.22%，抗氧化能力为11.5%。
对比实施例4：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）称取沙棘籽粕90g醇提预处理，液料比20:1、醇体积分数70%、预处理时间30min、预处理温度55℃、3次，过滤，得沙棘籽粕醇提渣，50℃干燥，粉碎，过50目筛，备用。（3）沙棘醇提渣、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:40、蛋白酶添加量为1.5%、氢氧化钠水溶液ph为11.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白h。经试验测定，沙棘籽粕蛋白h的提取得率为24.74%，抗氧化能力为18.1%。
对比实施例5：一种具有抗氧化活性的沙棘籽粕非可溶性蛋白及其制备方法
（1）沙棘籽粕100g粉碎，备用；（2）沙棘籽粕、蛋白酶、氢氧化钠水溶液按比例充分混匀，料液比1:44、蛋白酶添加量为1.4%、氢氧化钠水溶液ph为12.0，60℃恒温水浴提取30min，离心得上清液测定蛋白含量和抗氧化能力，干燥，得沙棘籽粕蛋白i。经试验测定，沙棘籽粕蛋白i的提取得率为18.56%，抗氧化能力为10.37%。
小结：
（1）本发明研究发现，沙棘籽粕醇提渣中含有丰富的非可溶性蛋白成分，且如果不进行醇提预处理，采用酶解-碱提联用法无法达到高非可溶性蛋白提取得率，而且常常被沙棘籽粕可溶性蛋白掩盖或干扰；
（2）本发明研究发现，酶解-碱提联用法受多种因素影响，尤其是料液比、蛋白酶添加量、水溶液ph，如实施例或对比例所呈现，并非显而易见的；
（3）本发明提供的沙棘籽粕非可溶性蛋白具有较强的抗氧化能力，可以作为一种抗氧化制剂和/或产品的添加物用于食品、医药和化妆品行业。