一种淋巴瘤预后试剂盒的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种淋巴瘤预后试剂盒。

背景技术：

淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要表现为无痛性淋巴结肿大，肝脾肿大，全身各组织器官均可受累，伴发热、盗汗、消瘦、瘙痒等全身症状。

根据瘤细胞分为非霍奇金淋巴瘤(nhl)和霍奇金淋巴瘤(hl)两类。病理学特征在霍奇金淋巴瘤为瘤组织内含有淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和特异性的里-斯(reed-steinberg)细胞，hl按照病理类型分为结节性富含淋巴细胞型和经典型，后者包括淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型和淋巴细胞消减型。nhl发病率远高于hl,是具有很强异质性的一组独立疾病的总和，病理上主要是分化程度不同的淋巴细胞、组织细胞或网状细胞，根据nhl的自然病程，可以归为三大临床类型，即高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤。根据不同的淋巴细胞起源，可以分为b细胞、t细胞和nk细胞淋巴瘤。淋巴瘤临床表现多样，虽然可以有慢性、进行性、无痛性淋巴结肿大，但也可以表现为其他系统受累或全身症状。临床上怀疑淋巴瘤时，可以做淋巴结或其他受累组织或器官的病理切片检查(活检)以确诊。

淋巴瘤的预后和病理、分期、病人的体能等因素有关，有些患者得了淋巴瘤以后，看上去非常虚弱，体能比较差，可能预后就比较差。还有一个因素就是病人的肿瘤负荷，以及治疗是否规范综合考虑。因此淋巴瘤的预后需参考患者年龄、体能状态、病情分期及病人治疗是否规范等因素判别，不能一概而论。一般而言，预后较好，早期淋巴瘤患者2年生存率可达70％左右，5年生存率可达50％以上。

因此，淋巴瘤的预后评估及治疗同样重要，对人体的生命健康十分重要。而现有技术中并未发现良好的可以检测淋巴瘤预后效果的方法。

因此，开发一种淋巴瘤预后试剂盒对人类健康至关重要。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺点，本发明创造性的提供了一种淋巴瘤预后试剂盒。该试剂盒包含五种试剂，可以通过检测hoxc5基因，srprb基因，celf2基因，prr36基因甲基化的表达水平，进而判断成人t淋巴细胞的预后。本发明首次提供了一种针对成人t淋巴母细胞淋巴瘤的预后试剂盒，可以有效预测成人t淋巴母细胞淋巴瘤病人的预后，并可为适合骨髓移植的患者做出有指导意义的评价。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种淋巴瘤预后试剂盒，包含五种试剂：检测hoxc5甲基化位点的序列，检测srprb甲基化位点的序列，检测celf2甲基化位点的序列和检测prr36甲基化位点的序列。

优选地，五种试剂中甲基化序列信息分别为：hoxc5甲基化序列信息如seqidno.1所示；srprb甲基化序列信息如seqidno.2所示；celf2甲基化序列信息如seqidno.3所示；prr36甲基化序列信息如seqidno.4所示。

aagtgatagtaggagttatata(seqidno.1)；

gattttaggttagagaagattt(seqidno.2)；

aattagaaattagttgagtgaa(seqidno.3)；

gaaaggaataggaggg(seqidno.4)；

优选地，扩增hoxc5甲基化序列的为引物hoxc5；扩增srprb甲基化序列的为引物srprb；扩增celf2甲基化序列的为引物celf2；扩增prr36甲基化序列的为引物prr36。

优选地，引物hoxc的上游序列如seqidno.5所示，下游引物序列如seqidno.6所示；引物srprb的上游序列如seqidno.7所示，下游引物序列如seqidno.8所示；引物celf2的上游序列如seqidno.9所示，下游引物序列如seqidno.10所示；引物prr36的上游序列如seqidno.11所示，下游引物序列如seqidno.12所示。

hoxc5-f：tatttggttggtgtagttgtttatagtagg(seqidno.5)；

hoxc5-r：aaatttcacccaaatcccaatca(seqidno.6)；

srprb-f：ttgttagattatttttggaagtgatagtag(seqidno.7)；

srprb-r：taaaactattccacctcaaatcatcaa(seqidno.8)；

celf2-f：agggatttatagtagtgttttaaggaaga(seqidno.9)；

celf2-r：ttcataacccttacattacaaacctaac(seqidno.10)

prr36-f：gggaattttaggatgtaaggtagat(seqidno.11)；

prr36-r：ccctacaaaccactaaatcacctctcaca(seqidno.12)；

优选地，所述试剂盒还包括dntp，酶混合物，底物混合物。

优选地，所述酶混合物由dnapolymerase，atpsulfurylase，luciferase和apyrase按体积比1：1：1：1组成；所述底物混合物由aps和luciferin按体积比1：1组成。

与现有技术相比，本发明提供的淋巴瘤预后试剂盒，具有如下优点：

(1)本发明提供的淋巴瘤预后试剂盒，可以同时检测hoxc5基因，srprb基因，celf2及prr36甲基化位点，且检测结果精确可靠；

(2)本发明提供的淋巴瘤预后试剂盒，通过检测不同基因的甲基化位点，进一步评估淋巴瘤患者的预后情况，操作简单，且成本低，不会给患者带来痛苦；

(3)本发明提供的淋巴瘤预后试剂盒，可以直接根据甲基化值判断淋巴瘤病人的预后效果，参考价值高，可以为适合骨髓移植的患者做出有指导意义的评价。

附图说明

图1为构建cpg标签各预后指标结果图；

图2.为四个cpg位点的分布及临床价值示意图；

图3为构建cpg标签的分布及临床价值示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1dna的制备

1.石蜡标本中提取dna

将石蜡标本放置于1mlep管中，使用梯度二甲苯和酒精进行脱蜡处理后，加入180ulatlbuffer和20ul蛋白水解酶，放入56℃水浴锅孵育过夜。待组织消化完毕，90℃金属浴1小时，使用200ulatlbuffer和200ul乙醇混匀，离心后将上清移至吸附柱内，13000rpm离心后，将离心柱内液体离心至收集管中，弃去收集管，将吸附柱放于新的收集管中，加入aw1buffer500ul1200rpm离心1min，后再加入aw2500ul离心1分钟，将吸附柱放于干净的1.5mlep管中，加入100ulatebuffer，置于70℃10分钟，13000rpm离心2分钟，加入50ulpbs-20℃保存。

2.新鲜组织中提取dna

将新鲜组织加入含有蛋白酶k的裂解液中，55℃消化2小时。将溶液冷却至室温，加入等体积的苯酚，将离心管缓慢颠倒10分钟，使两相温和地混合。然后将离心管置于旋转器上1小时。室温静置两相分离后，将水相转移至另一离心管。加入0.2倍体积10m醋酸氨及2倍体积乙醇，旋转离心管至溶液彻底混匀。室温5000g离心5分钟后收集沉淀。将残余的乙醇使用真空泵吸去，加入200ulpbs-20℃保存。

实施例2预后评估过程

1.将1个特异性的测序引物和dna模版结合，然后加入200ul酶混合物(dna、polymerase、atpsulfurylase、luciferase、和apyrase)，和底物混合物(aps和luciferin)。

2.向反应体系中加入1中dntp，如果它刚好能和dna模版的下一个碱基配对，则会在dna聚合酶的作用下，添加扫测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(ppi)。

3.在atp硫酸化酶的作用下，生成的ppi可以和aps结合形成atp；在荧光素酶的催化下，生成的atp又可以和荧光素形成氧化荧光素，通过ccd光学系统即可获得特异的检测峰值，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。

4.反应体系中剩余的dntp和残留的少量atp在apyrase作用下发生降解。

5.加入另一种dntp，使2-4反应重复进行，根据获得的峰值图即可得到相应数值。

6.根据候选4个甲基化的数值，按照公式rs＝(0.812×srprb的值)+(0.253×celf2的值)+(1.044×hoxc5的值)-(0.163×prr36的值)。如果某病人rs值>1.05，则判断病人是处于一种高危的状态(预后较差)，建议病人进行更强烈的治疗方案。

具体试验结果如图1、图2及图3所示，图1中，a表示lasso-logistic检验鉴定复发-非复发的差异cpg位点；b表示svm-rfe算法鉴定复发-非复发的差异cpg位点；c表示经过lasso-logistic和svm-rfe算法鉴定候选cpg位点合集；d表示热图聚类显示复发-非复发的cpg位点；e表示lasso-cox算法鉴定和预后密切相关的4个候选cpg位点。

图2中，a、b、c和d分别对应的是srprb、celf2、hoxc5和prr36基因。左图：点状图显示的是4个cpg位点在训练集、内部验证集及外部验证集的分布；中图：显示的是4个cpg位点的最佳的阈值；右图：显示的是4个cpg位点的表达水平与预后之间的关系。

图3中，a图显示的是cpg标签在训练集、内部验证集及外部验证集的分布；b图显示的是cpg标签的最佳的阈值；c图显示的是cpg标签的表达水平与预后之间的关系。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>中山大学肿瘤防治中心

<120>一种淋巴瘤预后试剂盒

<130>2019.12.3

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>hoxc5甲基化序列(artificialsequence)

<400>1

aagtgatagtaggagttatata22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>srprb甲基化序列(artificialsequence)

<400>2

gattttaggttagagaagattt22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>celf2甲基化序列(artificialsequence)

<400>3

aattagaaattagttgagtgaa22

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>prr36甲基化序列(artificialsequence)

<400>4

gaaaggaataggaggg16

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>hoxc5-f

<400>5

tatttggttggtgtagttgtttatagtagg30

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>hoxc5-r

<400>6

aaatttcacccaaatcccaatca23

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>srprb-f

<400>7

ttgttagattatttttggaagtgatagtag30

<210>8

<211>27

<212>dna

<213>srprb-r

<400>8

taaaactattccacctcaaatcatcaa27

<210>9

<211>29

<212>dna

<213>celf2-f

<400>9

agggatttatagtagtgttttaaggaaga29

<210>10

<211>28

<212>dna

<213>celf2-r

<400>10

ttcataacccttacattacaaacctaac28

<210>11

<211>25

<212>dna

<213>prr36-f

<400>11

gggaattttaggatgtaaggtagat25

<210>12

<211>29

<212>dna

<213>prr36-r

<400>12

ccctacaaaccactaaatcacctctcaca29