一种靶向高尔基体的半胱氨酸荧光探针、制备方法与应用与流程

本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种靶向高尔基体的荧光探针及其在测量、检测或筛选半胱氨酸及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。

背景技术：

半胱氨酸是生物体中硫的主要形态，参与许多生理和病理过程，在维持生物系统氧化还原稳态方面发挥重要作用。在抗氧化防御系统中，半胱氨酸可以通过降解活性氧，保护健康细胞中的生物分子，提高细胞中半胱氨酸的产生，还可以逆转炎症诱导的细胞异常，并通过保护细胞来提高细胞存活率。更重要的是，一些生理和病理过程，如衰老和神经退行性疾病，与氧化/抗氧化平衡和半胱氨酸水平的变化有关。高尔基体作为一种重要的细胞器，参与蛋白质的包装和运输，在生命体中发挥重要作用，由于缺乏检测高尔基体中的半胱氨酸的有效技术，间接导致半胱氨酸在高尔基体中的作用机制还没有被完全的阐明。因此，寻求一种特定和灵敏检测生命体尤其是高尔基体中的半胱氨酸的技术是至关重要的。

鉴于此，发展能够有效检测特别是在高尔基体中对半胱氨酸的含量波动进行监测的分析方法是极其重要和有意义的。近年来，已报到道的检测半胱氨酸的方法有分光光度比色法、高效液相色谱法、化学发光分析法、荧光探针分析法等，其中荧光探针因其高选择、超灵敏、合成简单等独特的优势而成为研究者关注的焦点。目前已报道的半胱氨酸荧光探针分析方法仍存在一定的缺陷，譬如，灵敏度低、选择性差、水溶性差、合成复杂等，同时，也无法同时靶定高尔基体；并且生命体内其他硫醇类化合物与半胱氨酸的性质相似，会对半胱氨酸的检测构成潜在干扰，同时，生理环境中的半胱氨酸的含量较低。因此，发展高选择性、抗干扰、超灵敏并且具有靶定高尔基体功能的半胱氨酸荧光探针成为亟需解决的课题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类半胱氨酸荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性高、抗干扰能力强、灵敏度高的特点，并且能够表现出优益的高尔基体靶向定位效果，且能对高尔基体中的半胱氨酸进行测量、检测或筛选和成像。

具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(ⅰ)所示的结构：

式(i)化合物中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8均为氢原子的式(i)化合物，其结构式如下：

本发明还提供了式(ⅰ)或式(ⅱ)化合物的制备方法，以式(ⅲ)化合物、1,1-硫代羰基二咪唑和丙硫醇为原料，按照如下反应路线进行反应制备：

式(i)、式(ⅳ)和式(ⅲ)中：r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8可以相同或不同。

在本发明的一些具体实施方案中，将r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8均为氢原子的式(ⅲ)化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应6-24小时，然后将丙硫醇加入到上述溶液中，其中式(ⅲ)化合物与丙硫醇的摩尔比为1:1-1:6，继续常温反应6-24小时，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂，得到粗产品；粗产品继续提纯分离，得到纯净的式(ⅰ)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述分离提纯方法为色谱柱分离。

在本发明的一些具体实施方案中，所述色谱柱分离使用的洗脱剂为石油醚和二氯甲烷的混合溶剂。

本发明还提供了用于测量、检测或筛选半胱氨酸的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(i)化合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述式(i)化合物具有以下结构：

在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。

本发明还提供了检测样品中半胱氨酸的存在或测定样品中的半胱氨酸含量的方法，其包括：

a)使所述式(i)或式(ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；

b)测定所述荧光化合物的荧光性质。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。

在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。

本发明还提供了检测样品中半胱氨酸的存在或测定样品中的半胱氨酸含量的试剂盒，其包含所述式(i)或式(ii)化合物。

本发明还提供了所述式(i)或式(ii)化合物在细胞荧光成像中的应用。

本发明还提供了所述式(i)或式(ii)化合物作为荧光探针在靶向定位高尔基体测量、检测或筛选半胱氨酸中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

(1)选择性高，抗干扰能力强

本发明的硫化氢探针可选择性的与半胱氨酸发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，包括但不限于如下分析物：脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、dl-异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、组氨酸、钾离子、钠离子、钙离子、镁离子、亚硫酸氢根、亚硫酸根、硫酸根、抗坏血酸等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。

(2)灵敏度高

本发明的半胱氨酸荧光探针与半胱氨酸反应非常灵敏，从而有利于对半胱氨酸的检测。

(3)能够靶向定位高尔基体

本发明的半胱氨酸荧光探针可在生理水平条件下应用，尤其是能够靶向定位高尔基体，快速对高尔基体中的半胱氨酸进行测量、检测或筛选，并且可以应用于活细胞荧光成像。

(4)稳定性好

本发明的半胱氨酸探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。

(5)合成简单

本发明的半胱氨酸荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1(a)探针(5μm)加入半胱氨酸(0-10μm)前后的荧光光谱；

图1(b)探针(5μm)定量分析不同浓度半胱氨酸(0-10μm)的工作曲线；

图2探针(5μm)加入半胱氨酸(20μm)后，515nm处的荧光强度值随时间的变化情况。

图3人体内常见的物质对探针(5μm)的荧光强度的影响。其中编号1-23分别为空白、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、dl-异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、组氨酸、钾离子、钠离子、钙离子、镁离子、亚硫酸氢根、亚硫酸根、硫酸根、抗坏血酸、半胱氨酸(20μm)(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μm)，除特殊标注外分析物的浓度均为1mm。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在515nm处的荧光强度值；

图4不同分析物随时间变化对探针(5μm)荧光光谱的影响。

图5共聚焦显微镜观察探针(5μm)对高尔基体的共定位能力。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1：式(ii)化合物的合成

合成设计路线如下：

步骤a)

步骤b)

实施方案1：将500mg(1.73mmol)4-三氟甲基-7-氨基喹啉类化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应12h，再将132mg(1.73mmol)丙硫醇加入到上述溶液中，常温反应12h，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂。将粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合体系(v/v＝2:1)进行柱色谱分离得到纯品，得到白色纯净产品340mg，产率为48％。

实施方案2：将500mg(1.73mmol)4-三氟甲基-7-氨基喹啉类化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应12h，再将264mg(3.46mmol)丙硫醇加入到上述溶液中，常温反应12h，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂。将粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合体系(v/v＝2:1)进行柱色谱分离得到纯品，得到白色纯净产品420mg，产率为60％。

实施方案3：将500mg(1.73mmol)4-三氟甲基-7-氨基喹啉类化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应12h，再将396mg(5.19mmol)丙硫醇加入到上述溶液中，常温反应12h，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂。将粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合体系(v/v＝2:1)进行柱色谱分离得到纯品，得到白色纯净产品490mg，产率为70％。

实施方案4：将500mg(1.73mmol)4-三氟甲基-7-氨基喹啉类化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应12h，再将528mg(6.92mmol)丙硫醇加入到上述溶液中，常温反应12h，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂。将粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合体系(v/v＝2:1)进行柱色谱分离得到纯品，得到白色纯净产品520mg，产率为75％。

实施方案5：将500mg(1.73mmol)4-三氟甲基-7-氨基喹啉类化合物与三乙胺溶于n,n-二甲基甲酰胺中，将含有1,1-硫代羰基二咪唑的n,n-二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到上述混合溶液中，然后常温反应12h，再将528mg(6.92mmol)丙硫醇加入到上述溶液中，常温反应6h，萃取，减压条件下旋蒸干溶剂。将粗产品用石油醚和二氯甲烷的混合体系(例如v/v,2:1)进行柱色谱分离得到纯品，得到白色纯净产品405mg，产率为58％。

实施例2：测试荧光探针对于半胱氨酸的浓度梯度

配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后将不同浓度的半胱氨酸加入到测试体系中，摇晃均匀后静置30分钟。上述测定是在乙醇:水＝3:7(10mmpbs,ph7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

用荧光光谱仪测试其荧光强度变化，从图1a可以清晰的看出，随着半胱氨酸浓度的增加，515nm处的荧光强度逐渐增强。并且，由图1b可以看出荧光探针(5μm)加入半胱氨酸(0-10μm)之后，其荧光强度的值与半胱氨酸的浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对半胱氨酸进行定量分析。

实施例3：测试荧光探针的时间动力学

从探针母液中取出50μl置于10ml的测试体系，然后将20μm的半胱氨酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在乙醇:水＝3:7(10mmpbs,ph7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

由图2可以清楚地看到，当半胱氨酸加入后，经检测30min左右荧光强度达到最大值并保持不变，这说明该探针与半胱氨酸反应迅速，能够为半胱氨酸的测定提供快速的分析方法。

实施例4：测试荧光探针对于半胱氨酸的选择性

分析物分别为空白、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、dl-异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、组氨酸、钾离子、钠离子、钙离子、镁离子、亚硫酸氢根、亚硫酸根、硫酸根、抗坏血酸、半胱氨酸(除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μm)。柱状图代表的是不同分析物存在下探针在515nm处的荧光强度值。上述测定是在乙醇:水＝3:7(10mmpbs,ph7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

具体地，配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后加入一定量的分析物，摇匀，待30分钟后测定。由图3可以清晰的看出，该探针对半胱氨酸具有高的选择性。

实施例5：测试荧光探针对于半胱氨酸的选择性

分析物分别为同型半胱氨酸(100μm)、硫化氢(100μm)、谷胱甘肽(1mm)、半胱氨酸(20μm)的荧光强度随时间的变化，点状图代表的是不同分析物存在下探针在515nm处的荧光强度。上述测定是在乙醇:水＝3:7(10mmpbs,ph7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且所有光谱测试都是在25℃下测得的。

具体地，配置多个探针浓度为5μm的平行样品于10ml比色管中，然后加入一定量的分析物，摇匀，每隔3分钟测定一次。由图4可以清晰的看出，该探针对半胱氨酸具有高的选择性。

实施例6：探针(5μm)对高尔基体的共定位能力测试

先用cys孵育hela细胞30分钟，再用探针和商业用的高尔基体探(bodipytr神经酰胺)孵育40分钟。通过共聚焦显微镜观察探针的共定位能力。由图5可看出，探针与高尔基体重叠效果好，表现出探针定位高尔基体的优异能力。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。