降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因及其应用。

背景技术：

灰飞虱作为我国粮食地区的主要害虫，除了直接取食危害粮食作物，还能传播多种作物病毒间接地危害作物，每年造成粮食作物减产30-50％甚至绝收。

目前灰飞虱防治主要以化学农药为主，然而灰飞虱对常用各类杀虫剂均产生了不同水平的抗性，导致其频繁暴发。20世纪70年代有机氯杀虫剂由于环境污染、高毒性和高抗性被禁止用于灰飞虱防治。80至90年代部分有机磷杀虫剂和氨基甲酸酯类杀虫剂被应用于稻田害虫防治，但效果一般、环境相容性差、选择性差。与此同时，作用机制新颖的噻嗪酮、氟虫腈和吡虫啉被相继引入稻田使用，不合理地用药却造成灰飞虱对噻嗪酮和吡虫啉产生极高水平的抗性，且氟虫腈因对水生生物高毒性于2009年被禁用。抗性监测表明，灰飞虱对现阶段使用的噻虫嗪、烯啶虫胺、毒死蜱、吡蚜酮和拟除虫菊酯类杀虫剂均产生了不同程度的抗性及敏感性下降。

灰飞虱抗药性分子检测技术应用是基于对灰飞虱抗药性分子机制的研究建立起来。目前灰飞虱对稻田常用杀虫剂的抗药性主要涉及代谢抗性和靶标抗性，代谢抗性主要是通过解毒代谢酶基因扩增或过表达，导致解毒代谢活性显著升高，解毒代谢能力增强而对杀虫剂形成抗性。靶标抗性是由于体内杀虫剂的靶标构象发生变化，导致杀虫剂与靶标结合力下降，不能有效地杀死灰飞虱，而表现出灰飞虱对杀虫剂敏感性下降。

经检索发现，专利号为201610567595.8的专利公开了一种灰飞虱抗药性羧酸酯酶基因lsce12、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用，利用该基因可获得降低灰飞虱抗药性的基因片段(即dsrna)，并进行喂食rnai，进而降低灰飞虱抗药性，使灰飞虱更容易被杀虫剂杀灭，减少了化学农药的使用量。虽然这种方法有效的减少了化学农药的使用量，但还是需要使用化学农药。

有鉴于此，急需对现有的防治灰飞虱的方法进行改进，以便于降低灰飞虱的繁殖力，减少种群数量，减少环境污染。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是现有的防治灰飞虱的方法存在一定缺陷的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段，该基因片段序列如seqidno.1所示。

本发明还提供：

根据前文所述降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因的获得方法，包括以下步骤：

第一步、从灰飞虱材料中提取灰飞虱总rna；

第二步、先以灰飞虱总rna为模板，反转录合成cdna第一链；

第三步、以cdna为模板，利用上游引物p1序列为seqidno.3和下游引物p2序列为seqidno.4进行pcr扩增，获得的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，产物纯化后进行测序，所获得的序列即为细胞凋亡基因；

第四步、对测序获得的细胞凋亡基因序列设计含有t7启动子的引物，体外合成细胞凋亡基因片段的dsrna并保存备用。

该细胞凋亡基因片段的合成方法进一步完善的技术方案如下：

优选的，第一步的具体过程为：

采用trizol法提取雌性灰飞虱成虫总rna；

第二步的具体过程为：

以灰飞虱总rna为模板合成cdna第一条链；

第三步的具体过程为：

以cdna为模板，通过上游引物p3和下游引物p4进行pcr扩增，将pcr获得的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标dna条带，运用t4连接酶将步骤s3中回收的目标dna片段连接至peasy-t1载体，并通过转化将其导入至大肠杆菌dh5α，涂于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃，培养过夜；

第四步的具体过程为：

从氨苄青霉素的lb固体培养基上挑取菌落，至含氨苄青霉素的lb液体培养基进行扩增培养，并提取克隆质粒。以质粒为模板，通过含有t7启动子的上游引物p3和下游引物p4进行扩增，扩增产物进行测序保证基因完整。以扩增产物为模板，体外合成细胞凋亡基因片段的dsrna并保存备用。

本发明还提供：

一种前文所述的细胞凋亡基因片段的合成方法中所用引物，所述上游引物p3的序列为5'端加有t7启动子序列的seqidno.6，所述下游引物p4的序列为5'端加有t7启动子序列seqidno.7。

本发明还提供：

一种前文所述降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的用途，用于降低灰飞虱的产卵量。

本发明还提供：

一种前文所述降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的合成方法，所述基因片段dsrna的浓度为3000-6000ng/μl。

本发明公开了一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因及其应用，降低灰飞虱产卵量的基因片段的序列如seqidno.1所示。本发明筛选出能导致灰飞虱产卵量显著性降低的细胞凋亡基因，通过分子生物学技术合成灰飞虱细胞凋亡基因片段的dsrna，利用该细胞凋亡基因片段的dsrna与饲料混合后饲喂灰飞虱，合成的灰飞虱细胞凋亡基因片段的dsrna能有效沉默基因，很好地抵抗rna酶的降解，降低灰飞虱的繁殖速度，减少种群数量，从而达到控制灰飞虱的目的。

附图说明

图1是本发明中降低灰飞虱产卵量lsdark基因的dna条带示意图；

图2是本发明中降低灰飞虱产卵量lsdark基因的dsrna条带示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因及其应用，通过分子生物学技术合成降低灰飞虱产卵量lsdark基因片段的dsrna，合成的lsdark基因片段dsrna与饲料混合后饲喂飞虱，能有效沉默lsdark基因，很好地抵抗rna酶的降解，降低灰飞虱的产卵量。

具体实施例1

降低灰飞虱产卵量基因lsdark的克隆方法，包括以下步骤：

s10、提取雌性成虫灰飞虱总rna(核糖核酸)，以灰飞虱总rna为模板合成cdna第一条链；

具体过程为，取雌性成虫灰飞虱卵巢40-50个，用trizol法提取总rna，以总rna为模板，反转录合成cdna第一条链。

s11、以合成的灰飞虱cdna第一条链为模板，通过上游引物p1和下游引物p2进行pcr扩增；

具体过程为，从灰飞虱基因组中获取基因片段序列，在ncbi数据库中进行同源性比对之后，预测为灰飞虱lsdark基因，利用ncbi数据库中primer-blast设计上游引物p1(seqidno.3)和下游引物p2(seqidno.4)，进行pcr扩增；

上游引物p1(seqidno.3)：5′-cgtctgctgaagtggtggat-3′

下游引物p2(seqidno.4)：5′-tcaggaaacacctctcgcac-3′

pcr扩增体系如下：4μl5×反应缓冲液buffer，2μldntp，1μl步骤(1)中cdna模板，2μl序列为seqidno.3的上游引物p1，2μl序列为seqidno.4的下游引物p2，0.5μltaq酶，8.5μlddh2o，共20μl；pcr扩增反应程序如下：95℃变性2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃1min，35个循环；72℃10min延伸；10℃保存。

s12、在步骤s2中获得的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标dna条带，回收的目标dna片段在t4连接酶作用下插入至peasy-t1载体中，转化到大肠杆菌dh5α，涂于含有x-gal、iptg以及氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃，培养过夜；

s13、从氨苄青霉素的lb固体培养基上挑取白色单菌落，至含氨苄青霉素的lb液体培养基进行扩增培养，并提取克隆质粒；

s14、对步骤s4中所获得的克隆质粒用全自动序列仪进行测序，获得seqidno.1所示的lsdark基因。

具体实施例2

降低灰飞虱产卵量基因lsdark的dsrna的合成方法，包括以下步骤：

s20、从雌性灰飞虱成虫中提取总rna，以灰飞虱总rna为模板合成cdna第一条链；

s21、以步骤s1中合成的灰飞虱cdna第一条链为模板，通过上游引物p3和下游引物p4进行pcr扩增，将pcr扩增产物经浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下切胶，采用axyprepdna凝胶回收试剂盒进行回收：

具体过程为，根据已经验证的lsdark基因序列，利用ncbi数据库中primer-blast设计上游引物p3(seqidno.6)和下游引物p4(seqidno.7)

上游引物p3(seqidno.6)：

5′-taatacgactcactataggggtgagcgatttgcctttggg-3′

下游引物p4(seqidno.7)：

5′-taatacgactcactataggggtagaccgccatccgattgt-3′

对照gfp基因设计上游引物p5(seqidno.8)和下游引物p6(seqidno.9)

上游引物p5(seqidno.8)：

5′-taatacgactcactatagggagaatgagtaaaggagaagaacttttc-3′

下游引物p6(seqidno.9)：

5′-taatacgactcactatagggagatttgtatagttcatccatgccatgt-3′

pcr扩增体系如下：10μl2×反应缓冲液buffer，2μl上游引物p3(seqidno.8)，2μl下游引物p4(seqidno.9)，2μlcdna模板，4μlddh2o，共20μl；pcr扩增反应程序如下：95℃变性3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃7min延伸。

具体切胶方法如下所示：

s210对紫外灯下切下含有目的基因dna的琼脂糖凝胶，放入称量过重量1.5ml微量离心管中，再次称量，获得所切胶重量；

s211根据获得凝胶的重量，加入3个凝胶体积的bufferde-a(100mg＝100μl体积)，混合均匀后于75℃水浴，间断混匀至凝胶完全熔化，再次加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b后混合均匀；

s212将混合液转移至dna制备管，于12,000×g离心1min，弃滤液；

s213加500μlbufferw1于dna制备管，于12,000×g离心30s，弃滤液；

s214加700μlbufferw2于dna制备管,于12,000×g离心30s，弃滤液；

s215再次加700μlbufferw2于dna制备管，于12,000×g离心1min，弃滤液；

s216不加液体，将dna制备管置于离心管中，12,000×g离心1min；

s217将dna制备管转移至新的1.5ml微量离心管中，加入30μlnuclease-freewater，室温放置1min，12,000×g离心1min；

s218收集目的dna产物保存温度为–20℃。

s22、步骤s2中pcr获得的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标dna条带，运用t4连接酶将步骤s3中回收的目标dna片段连接至peasy-t1载体，并通过转化将其导入至大肠杆菌dh5α，涂于含有氨苄青霉素的lb固体培养基，37℃，培养过夜；

s23、从氨苄青霉素的lb固体培养基上挑取菌落，至含氨苄青霉素的lb液体培养基进行扩增培养，并提取克隆质粒。以质粒为模板，通过含有t7启动子的上游引物p3和下游引物p4进行扩增，扩增产物进行测序保证基因完整。

pcr扩增体系如下：50μl2×反应缓冲液buffer，4μl上游引物p3(seqidno.6)，4μl下游引物p4(seqidno.7)，8μlcdna模板，34μlddh2o，共100μl；pcr扩增反应程序如下：95℃变性3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃7min延伸。

s24、将扩增目的基因的pcr产物进行纯化，以pcr产物为模板扩增得到降低灰飞虱产卵量的基因片段dsrna。

具体pcr扩增体系如下：2μl10×反应缓冲液buffer，2μlatp，2μlgtp，2μlutp，2μlctp，1μg。

s25中纯化的pcr产物为模板，2μlt7rnapolymerasemix，加ddh2o，共20μl；反应程序如下：37℃，6h。

实施例3

利用基因片段dsrna与饲料混合饲喂灰飞虱的方法如下：

s30、将灰飞虱饲料与基因片段dsrna(浓度为4000ng/μl)均匀混合；

s31、准备多个双通玻璃管，将双通玻璃管的一端用纱布和皮筋封好，用电动吸虫器吸取2-3龄的灰飞虱若虫加入双通玻璃管；

s32、用parafilm封口膜将双通玻璃管另一端封好，取另一封口膜，将灰飞虱饲料与细胞凋亡dsrna混合液封在两层封口膜之间。

用移液枪吸取100μl灰飞虱饲料与lsdark基因片段dsrna混合液(处理组)或者100μl灰飞虱饲料与对照gfp基因的dsgfp混合液(对照组)滴在两个封口膜的中央。

s33、将加好灰飞虱饲料与细胞凋亡dsrna混合液的双通玻璃管置于温度为25±1℃，相对湿度60％，光照周期16l-8d的地方。

利用飞虱的趋光习性使其趋食饲料，每24h换灰飞虱饲料与细胞凋亡dsrna的混合液或者灰飞虱饲料与对照gfp基因的dsgfp混合液；

s34、持续喂食灰飞虱羽化至成虫。

将雌成虫单独挑出置于带水稻苗的试管中，并配对，每24h查一次产卵量，直至雌成虫死亡。期间若雄成虫死亡，则重新加入雄成虫。

饲喂灰飞虱饲料与细胞凋亡基因片段的dsrna混合液的灰飞虱总产卵量对照如表1所示：

表1

以上结果表明，利用该细胞凋亡基因片段的dsrna与饲料混合后饲喂灰飞虱，可以显著地降低灰飞虱的繁殖力。

本发明并不局限于上述实施例，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中山大学

<120>降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4167

<212>dna

<213>灰飞虱(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

atggatcattatcaattggttttaaataagtgtaaagaattgatcataaatgatattaga60

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aagctgttgcgtgagactcgggtgacgtcatcggtaaagacggtgtgcatcggcaacggc3840

gctcgcgtgtttggcgccctttcctcgcaacgcatccatgttggccgctggcaggcagcc3900

aactttcgcatcgcatgcaccgaactgcacgccaagcagctcatcaaggctgccaaccac3960

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ttcaacagtagacagtttacagttacaaactccaacagtttgcagttggccgagccattc4080

tctgcactcaatatcaatccaacacctcctacacgacccagactgcacattaaaaggaag4140

cagcaacttttcaaagacaacttatag4167

<210>2

<211>1388

<212>prt

<213>灰飞虱(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

metasphistyrglnleuvalleuasnlyscyslysgluleuileile

151015

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