本发明属于微生物生态学领域，更加具体的讲，是涉及一种快速有效的筛选植物根际土壤中拮抗细菌的方法。
背景技术：
众所周知，植物根际土壤是一个微生物种群极其丰富的环境，而不同的微生物之间可能存在多种相互作用，如拮抗，寄生，共生。
研究这种拮抗现象的意义在于：首先它可以提供最直接的实验证据，证明同一生境下细菌之间确实存在拮抗作用，对微生物群落中细菌之间相互作用的研究有重要意义；其次可以应用此方法筛选对植物致病菌有抑制作用的细菌，进而可以将这些拮抗细菌应用于农业领域。那么，这就需要一种快速简便的筛选拮抗菌株的方法。
目前有很多学者致力于各种抑菌现象的研究，但大多集中在真菌与真菌之间，或者真菌与细菌、放线菌之间的拮抗，对细菌之间的相互拮抗研究较少。有研究者使用传统的牛津杯法研究了一种侧孢短芽孢杆菌s62-9对常见微生物的抑菌作用（张丹等，中国食品学报，2017，17（1）：55-61.），陈志谊等利用涂布法和滤纸片法对多个菌株混合的植物病原菌生防制剂中拮抗细菌菌株之间的互作关系及其对生物防治效果的影响进行研究（陈志谊等，植物病理学报，2005，35（6）：539-544.），但这些研究多是采用传统的牛津杯法测定上清液的抑菌活性，亦或使用传统的涂布平板法，或用滤纸片蘸取拮抗菌贴到平板上。这些方法都有一些缺陷，如传统的牛津杯法使用除去菌体的上清液测定抑菌活性，这样存在指示菌和拮抗菌之间无直接接触，抗菌物质无法连续产生等问题；而涂布平板法，指示菌涂布的不均匀会导致抑菌现象不清楚；若使用滤纸片，则会稀释拮抗菌液导致真实活菌数无法确定，而且容易污染杂菌。此类方法都普遍存在操作繁琐，工作量大，效果不佳等诸多问题。另外这些细菌是从不同环境中取得的，对同一生境下如植物根际土壤这种微生物种类丰富的环境中的细菌间的相互拮抗作用的研究鲜有报道，对其可能存在的诱导拮抗现象的研究也少之又少。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于针对传统牛津杯法操作繁琐、效率低的问题，提出一种高效筛选植物根际土壤中拮抗细菌的方法。本方法用单层半固体平板代替了双层平板，并且在牛津杯中加入了过夜培养的细菌菌液和新鲜培养基，无需过滤除菌步骤，使得操作更加简单。另外，细菌在牛津杯中生长，可以同步产生抑菌物质，提高了抑菌物质的含量，使得其筛选效率提高。
本发明采取的技术措施如下：一种筛选植物根际土壤拮抗细菌的方法，包括植物根际土壤样品中细菌分离、纯化和拮抗细菌筛选；
所述植物根际土壤样品中细菌的分离包括下述步骤：
1、样品土壤的处理：采集根际土壤后，加无菌水振荡处理获得菌悬液；
2、稀释液涂布平板：将菌悬液进行10倍梯度稀释（10-1,10-2,10-3，10-4,10-5），获得稀释液，将不同梯度的稀释液分别涂布于r2a固体培养基，然后将平板移入28℃恒温培养箱培养；
所述r2a固体培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph=7.4。
3、分离与纯化：根据平板上菌落的颜色、形态、大小特征，将特征不同的细菌单菌落挑出，在r2a固体培养基上划线，然后培养。
对挑出的细菌菌株进行纯化，每一株细菌菌株纯化至少三次，直到获得纯菌落，依次编号，加入甘油后冷冻保存。
所述拮抗细菌筛选包括如下步骤：
1、细菌菌液制备：将根际土壤中分离得到的所有菌株均分别接种到r2a液体培养基中，温度是28℃，转速是180rmp摇床培养，待菌株达到对数生长后期，稳定前期，收集菌液备用；从土壤中分离得到的细菌中选择任意一种为指示菌；在含有指示菌的平板上，指示菌之外的其它细菌均为拮抗菌。
所述r2a液体培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1000ml，ph=7.4。
2、指示菌处理：使用20ml的r2a半固体培养基（琼脂浓度范围为6g/l至10g/l，ph=7.4）。倾倒平板前加入20μl的指示菌菌液，振荡混合均匀后倾倒平板；
所述r2a半固体培养基是在r2a液体培养基中加入琼脂，琼脂浓度为6g/l—10g/l。
3、放入牛津杯：待混合菌液的培养基凝固后，直接在半固体培养基表面垂直放置已灭菌的牛津杯（规格为内径0.78cm、外径0.8cm、高1cm），静置10min待牛津杯自然下沉；
4、拮抗菌加入：依次在牛津杯中加入50μl待测拮抗菌菌液及50μl的无菌的r2a液体培养基；
5、静置3h，移入培养箱中培养5d，观察记录抑菌现象。
本发明在牛津杯中直接加入拮抗菌的菌液，最大程度的使得拮抗菌和指示菌之间可以直接接触；而加入新鲜培养基，保证了拮抗菌的生长及拮抗物质的连续产生；且采用半固体培养基混合菌液倾倒平板，解决了指示菌分布不均匀的问题；操作简单快捷，不易污染，效果好；同时在初步确定同一生境中存在细菌间相互拮抗现象后，为后续研究打下基础。本发明与传统的牛津杯法的效果对比，使用本发明获得的效果更明显。
具体实施方式
下面将以两个实施为例对本发明的所采取的方法进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本技术领域的研究者可以在不背离本发明基本要求的情况下，对本发明进行细节上的同等修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从正常商业途径得到。
下述实施例使用的培养基：
1、r2a液体培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1000ml，ph=7.4。。
2、r2a固体培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph=7.4。
3、r2a半固体培养基：在r2a液体培养基中加入琼脂，琼脂浓度为6g/l—10g/l。
实施例a柠条根际土壤样品1中的拮抗细菌的筛选。
首先，柠条根际土壤样品1中的细菌的分离、纯化，包括如下步骤：
1）从山西省榆次市某菜园中采集柠条根际土壤样品，标记为样品1；
2）样品1放入50ml离心管中，加无菌水30ml，水平振荡3次，每次1min，间隔30s；
3）静置10min，取100μl上清液加入到900μl无菌水中，振荡混和均匀，即完成一次稀释；共稀释五次，获得6个梯度稀释液，即0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液；
4）取10-1、10-3、10-4、10-5四个梯度的稀释液各50μl，分别涂布到r2a固体培养基上，放入28℃恒温培养箱中静置培养；
5）将不同梯度平板上颜色、形态、质地、大小不相同的单菌落分别挑出，依次编号。对挑出的菌株利用平板划线法进行纯化，纯化至少三次，直到获得纯培养后保种；该柠条根际土壤样品中共分离到9株菌株，分别编号ck01-ck09。
进一步地，柠条根际土壤样品1中拮抗细菌菌株的筛选方法包括如下步骤：
1、菌液制备：将纯化得到的9株细菌分别接种到r2a液体培养基中，28℃180rmp摇床培养直至对数生长后期，稳定前期时，收集菌液备用；
2、准备9个锥形瓶，分别配制琼脂浓度为10g/l的半固体培养基，灭菌后放入55℃烘箱备用；
3、指示菌的处理：将20μl菌液加入到r2a半固体培养基中，迅速振荡混匀后倒平板。一个平板对应一个菌株，样品1生境中共分离到9株细菌，即共需要9个指示菌平板；
4、放置牛津杯：待培养基凝固后用镊子将已灭菌的牛津杯（规格为内径0.78cm、外径0.8cm、高1cm）垂直放置到培养基表面，每个平板放置8个牛津杯（除自身外，其它菌株分别加到其中一个牛津杯中）。静置10min，待牛津杯自然下沉；
5、加拮抗菌菌液：按顺序依次在牛津杯中加入50μl待测拮抗菌菌液及50μl无菌的r2a液体培养基。一个菌株的菌液需要连续加样8次。直到9个平板全部加样完毕；
6、静置3h后，移入28℃恒温培养箱，培养5天，观察抑菌圈大小；
7、记录每个平板上抑菌现象，制作拮抗现象表格，详情参见表1。
表1本发明实施例a中筛选获得的拮抗菌株分布表
表1中，—代表无拮抗现象，+代表有拮抗现象
ck01-ck09是分离自拧条根际土壤的9种细菌。其中，ck09鉴定为辣椒榕杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为no:cctccm20191036；其余8种细菌未进行菌种鉴定。
从表1中可以得知该生境共5对拮抗现象，即ck09拮抗ck02/ck05/ck06/ck07，以及ck04拮抗ck02。
实施例b玉米根际土壤样品2中的拮抗细菌的筛选。
同样，首先是玉米根际土壤样品2中的细菌的分离与纯化，包括如下步骤：
1）从山西省榆次市某菜园中采集玉米根际土壤样品，标记为样品2；
2）样品放入50ml离心管中，加无菌水30ml，水平振荡3次，每次1min，间隔30s；
3）静置10min，取上清液，并对其进行10倍梯度稀释，共稀释五次，获得6个梯度稀释液，0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5这6个梯度稀释液；
4）取10-1、10-3、10-4、10-5四个梯度的稀释液各50μl，分别涂布到r2a固体培养基上，放入28℃恒温培养箱中静置培养；
5）将不同梯度平板上颜色、形态、大小等特征不同的单菌落分别挑出，依次编号，对挑出的菌株以平板划线法反复纯化，直到获得纯培养后保种；该样品中共分离到8株菌株，分别编号zm01-zm08。
进一步地，是玉米根际土壤样品2中拮抗细菌菌株的筛选，包括如下步骤：
1）菌液制备：纯化得到的8株菌株分别接种至r2a液体培养基中，28℃180rmp摇床培养直到对数生长后期，稳定前期；
2）准备8个锥形瓶，分别配制琼脂浓度为10g/l的半固体培养基，灭菌后放入55℃烘箱备用；
3）指示菌的处理：同实施例a相同，将20μl的菌液加入到r2a半固体培养基中，迅速振荡混和均匀后倒平板，同样按照一株细菌对应一个平板的规则，共准备8个指示菌平板；
4）放置牛津杯：培养基凝固后在其表面垂直放置已灭菌的牛津杯，每个平板中放置7个牛津杯（除自身外，其它菌株分别加到其中一个牛津杯中）。静置10min，待牛津杯自然下沉；
5）加拮抗菌菌液：按顺序依次在牛津杯中加入50μl待测拮抗菌菌液及50μl无菌的r2a液体培养基。一个菌株的菌液需要连续加样7次，直到8个平板全部加样完毕；
6）静置3h后，小心移入28℃恒温培养箱，培养5d观察抑菌现象；
7）记录每个平板上的抑菌现象，制作表格，详情参见表2。
表2本发明实施例b中筛选获得的拮抗菌株分布表
表2中，—代表无拮抗现象，+代表有拮抗现象
zm01-zm08是分离自玉米根际土壤的8种细菌，均未进行菌种鉴定。
从表2中可以得知该生境共1对拮抗现象，即zm07拮抗zm05。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域研究人员而言是可行的。所以，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。