一种ICD诱导剂-IDO抑制剂缀合物及制备方法与应用与流程

本公开涉及一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物及制备方法与应用。

背景技术：

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

肿瘤的免疫逃逸有助于肿瘤的发生发展，其中，肿瘤免疫逃逸的机制包括肿瘤自身的改变、肿瘤诱导微环境的改变以及肿瘤微环境促进肿瘤的发展。近年来，针对免疫逃逸环节的免疫疗法于肿瘤治疗中取得了显著的成功。免疫疗法涉及多个因素和环节，与肿瘤细胞自身和肿瘤微环境的改变均有机制复杂的联系，目前在临床实践过程中仍面临着较大的挑战。

肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)的产生是激活t细胞的一个重要因素，然而，肿瘤细胞常常通过一系列改变(如抗原表达的丢失、内吞抗原或抗原脱落等方式)来抑制t细胞的活化，从而躲避机体免疫系统的监视并伺机生长。另外，肿瘤细胞可像病毒一样发生“抗原漂移”，导致抗原表位突变而改变肿瘤的抗原性，继而逃避t细胞介导的攻击。

近来研究发现，用特定化学药物或放射线治疗肿瘤时，肿瘤细胞在发生凋亡的同时，从非免疫原性细胞转化为免疫原性细胞，并由此激发机体内抗肿瘤的免疫杀伤效应，此现象被称之为肿瘤细胞的免疫原性死亡。研究发现某些蒽环类化合物和奥沙利铂等化疗药物不仅诱导肿瘤细胞凋亡，而且可以引起免疫原性细胞死亡(icd)，通过诱导肿瘤细胞自噬，释放3类信号：钙网蛋白暴露在细胞表面，刺激树突状细胞(dc)吞噬；三磷酸腺苷释放，招募dc进入肿瘤灶；高迁徙率族蛋白b1促进dc与垂死肿瘤细胞形成稳定结合，诱导机体产生特异性的t细胞抗肿瘤免疫。

吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，ido)是肝脏外唯一催化色氨酸(trp)沿犬尿氨酸(kyn)途径分解代谢的限速酶。ido与肿瘤免疫逃逸密切相关，可通过多种机制介导肿瘤免疫逃逸:色氨酸耗竭抑制局部t细胞增殖，色氨酸代谢产物促进t细胞凋亡，诱导调节性t细胞增殖等。鉴于ido在肿瘤免疫耐受的形成和维持中所发挥的重要作用，其已经成为抗肿瘤免疫治疗的新靶点。然而，临床前研究结果提示，ido抑制剂单用的肿瘤杀伤活性较弱，抑制率在30％～50％，为提高ido抑制剂的临床治疗效果，将其与化疗药物联合使用是一种重要的策略。

联合用药可实现化疗药的icd诱导作用与ido抑制剂的免疫相关代谢调节作用的协同，从而达到更佳的肿瘤治疗效果。据本公开发明人所知，目前对于icd诱导剂和ido抑制剂的联合用药的研究多为利用附加载体进行两药的共递送，然而，经本公开发明人研究发现，这种附加载体进行共递送的方式较为繁琐。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物及制备方法与应用，采用缀合物的方式同时递送icd诱导剂和ido抑制剂，更为方便。

为了实现上述目的，本公开的技术方案为：

第一方面，本公开提供了一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物，其结构式如下：

本公开利用体内三羧酸循环中的反应物琥珀酸，即丁二酸的两个羧基作为能与dox及nlg919产生易裂解连接部分的桥联物，从而使得两药形成dox-nlg919缀合物。据本公开发明人基于目前的研究发现，采用丁二酸作为桥联物时，能够获得dox和nlg919缀合物，而采用其他二酸或多酸，难以获得dox和nlg919缀合物。

第二方面，本公开提供了一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的制备方法，将nlg919与丁二酸酐进行酯化反应获得nlg919-sa，nlg919-sa与dox进行酰胺化反应获得icd诱导剂-ido抑制剂缀合物；

nlg919-sa的结构式为

icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的结构式为

本公开通过实验证实，采用丁二酸能够制备icd诱导剂-ido抑制剂缀合物。其次，丁二酸酐与nlg919、dox的反应顺序也影响icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的成功合成，本公开研究发现，先将nlg919与丁二酸酐合成，然后再与dox反应可以成功制备icd诱导剂-ido抑制剂缀合物，而若顺序调换，则无法获得icd诱导剂-ido抑制剂缀合物。

第三方面，本公开提供了一种上述icd诱导剂-ido抑制剂缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

第四方面，本公开提供了一种上述icd诱导剂-ido抑制剂缀合物在单药递送系统中的应用。

本公开的有益效果为：

1.本公开提供了一种用于瘤治疗过程中可实现类似单药递送的免疫原性细胞死亡(icd)诱导剂-色氨酸代谢阻断剂缀合物，该缀合物包括能够引起强烈效应t细胞免疫反应的icd诱导化疗药、阻断色氨酸代谢为犬尿氨酸的吲哚胺2,3双加氧酶(ido)抑制剂。

2.本公开提供的缀合物的桥连物为丁二酸，丁二酸通过酯键和酰胺键将icd诱导剂和色氨酸代谢阻断剂连接在一起，同时酯键和酰胺键易被瘤内大量存在的酯酶与酰胺酶水解，从而释放icd诱导剂和色氨酸代谢阻断剂。

3.本公开首次合成了一种从属不同作用机制并可协同抗癌的dox-nlg919缀合物，为协同递药带来了极大的便利。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本公开实施例1制备的nlg919-sa的核磁共振氢谱(¹hnmr)图。

图2为本公开实施例1制备的nlg919-sa的电喷雾质谱(esi-ms)图。

图3为本公开实施例1制备的dox-nlg919缀合物的核磁共振氢谱(¹hnmr)图。

图4为本公开实施例1制备的dox-nlg919缀合物的电喷雾质谱(esi-ms)图。

图5为本公开实施例2制备产物的电喷雾质谱(esi-ms)图。

图6为本公开实施例3制备产物的电喷雾质谱(esi-ms)图。

图7为本公开实施例4中dox-nlg919缀合物抑制体内乳腺肿瘤生长，通过dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗，以及用pbs对照治疗的比较。

图8为本公开实例4中通过dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗，以及用pbs对照治疗的小鼠体内肿瘤的荧光定量检测图。

图9为本公开实例4中通过荧光定量检测dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗，以及用pbs对照治疗的小鼠体内荧光强度。

图10为本公开实例4中通过荧光定量检测dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗，以及用pbs对照治疗的小鼠体内肿瘤体积的大小。

图11为本公开实例4中通过用dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗与用pbs对照治疗比较减少的肿瘤重量。

图12为本公开实例4中与用pbs对照治疗比较，用dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗期间小鼠的平均重量。

图13为本公开实例5中4t1细胞通过用不同浓度的dox、nlg919、dox-nlg919缀合物(浓度范围为0-18ug/ml)，治疗后的存活率。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于利用附加载体进行两药共递送的方式较为繁琐的不足，本公开提出了一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物及制备方法与应用。

本公开的一种典型实施方式，提供了一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物，其结构式如下：

本公开利用体内三羧酸循环中的反应物琥珀酸，即丁二酸的两个羧基作为能与dox及nlg919产生易裂解连接部分的桥联物，从而使得两药形成dox-nlg919缀合物。据本公开发明人基于目前的研究发现，采用丁二酸作为桥联物时，能够获得dox和nlg919缀合物，而采用其他二酸或多酸，难以获得dox和nlg919缀合物。

本公开的另一种实施方式，提供了一种icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的制备方法，将nlg919与丁二酸酐进行酯化反应获得nlg919-sa，nlg919-sa与dox进行酰胺化反应获得icd诱导剂-ido抑制剂缀合物；

nlg919-sa的结构式为

icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的结构式为

本公开通过实验证实，采用丁二酸能够制备icd诱导剂-ido抑制剂缀合物。其次，丁二酸酐与nlg919、dox的反应顺序也影响icd诱导剂-ido抑制剂缀合物的成功合成，本公开研究发现，先将nlg919与丁二酸酐合成，然后再与dox反应可以成功制备icd诱导剂-ido抑制剂缀合物，而若顺序调换，则无法获得icd诱导剂-ido抑制剂缀合物。

其合成路线如下所示：

该实施方式的一种或多种实施例中，酯化反应的催化剂为4-二甲氨基吡啶(dmap)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)。

该系列实施例中，酯化反应的温度为室温。本公开所述室温是指室内的环境温度，一般为15～30℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，酯化反应的溶剂为二氯甲烷。

该实施方式的一种或多种实施例中，nlg919-sa的纯化过程为：将酯化反应后的混合物液加入至饱和氯化铵溶液中，采用二氯甲烷进行萃取，将萃取的有机相溶于乙醇与氯仿的混合溶液中进行重结晶。

该系列实施例中，萃取后的有机相采用硫酸钠干燥后进行重结晶。

该系列实施例中，乙醇与氯仿的体积比为1:3.8～4.2。

该系列实施例中，重结晶的温度为-22～-18℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，酰胺化反应的催化剂为n,n-二异丙基乙胺和hbtu。

该实施方式的一种或多种实施例中，酰胺化反应时间为20～28h。

该实施方式的一种或多种实施例中，酰胺化反应设定时间后，添加盐酸终止反应。

该实施方式的一种或多种实施例中，酰胺化反应后的物料进行水洗，然后采用硅胶柱层析进行纯化。

该系列实施例中，硅胶柱层析的流动相为二氯甲烷与甲醇的混合液。当二氯甲烷与甲醇的体积比为10:0.9～1.1时，纯化效果更好。

本公开的第三种实施方式，提供了一种上述icd诱导剂-ido抑制剂缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本公开的第四种实施方式，提供了一种上述icd诱导剂-ido抑制剂缀合物在单药递送系统中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

(1)nlg919-sa的合成：

取一个洁净干燥的25ml磨口圆底烧瓶，精密称定一定量的0.048gnlg919、0.00083gdmap，溶于3ml二氯甲烷中，搅拌条件下加入一定量的0.019g丁二酸酐和33μldipea，然后于室温下密封搅拌过夜。反应混合液倒入至饱和的3ml氯化铵溶液中，混匀后，用二氯甲烷萃取3次，并将合并的有机相层用硫酸钠干燥，粗产物溶于乙醇：氯仿＝1:4的有机试剂中，于-20℃的条件下得结晶物，白色结晶固体即为所制得的0.061gnlg919-sa(产量为95％)，结构表征如图1～2所示。

(2)dox-nlg919缀合物的合成：

取一个洁净干燥的25ml磨口圆底烧瓶，精密称定一定量的0.0217gnlg919-sa、0.0324ghbtu，精密量取一定量的14.25μldipea，溶于无水9mldmf中，搅拌条件下反应10min；另精密称定一定量的0.0393gdox·hcl，加入至上述反应液中，搅拌条件下反应24h。然后，加入适量0.1nhcl以终止反应，去除反应液中的水相层，有机相层被水洗2次后，用无水硫酸钠干燥过夜；将干燥产物置于硅胶柱内，干法上样，用配比为二氯甲烷：甲醇＝10:1的流动相洗脱，点板观察以收集产物，合并洗脱下来的产物并做减压蒸干处理，最终得到所制0.0417gdox-nlg919(产率为81％)缀合物，结构表征如图3～4所示。

实施例2

nlg919-顺-乌头酸酐(ca)的合成

取一个洁净干燥的25ml磨口圆底烧瓶，精密称定一定量的0.048gnlg919、0.00083gdmap，溶于3ml二氯甲烷中，搅拌条件下加入一定量的0.030gca和33μldipea，然后于室温下密封搅拌过夜。反应混合液倒入至饱和的3ml氯化铵溶液中混匀，用二氯甲烷萃取3次，并将合并的有机相层用硫酸钠干燥，将干燥产物置于硅胶柱内，干法上样，用配比为乙醇：氯仿＝1:4的流动相洗脱，点板观察以收集产物，合并洗脱下来的产物并做减压蒸干处理。所得产物经质谱鉴定，结构表征如图5所示，无目标产物的分子离子峰438.17。

实施例3

取一个洁净干燥的25ml磨口圆底烧瓶，精密称定一定量的116.0mgdox·hcl和22.0mgsa溶解于10.0ml无水dmf中，再加入33.5μl三乙胺，氮气保护下避光反应24h。然后反应混合液与100.0ml冷乙酸乙酯混合，冷酸性饱和氯化钠(ph2-3)洗涤。收集有机层并用硫酸钠干燥，将干燥产物置于硅胶柱内，干法上样，用配比为氯仿：甲醇：乙酸＝17：3：1的流动相洗脱，点板观察以收集产物，合并洗脱下来的产物并做减压蒸干处理。之后所得产物与nlg919反应，将28.2mgnlg919溶于3ml无水dcm中，然后将64.4mgdox-sa、57.3mgedc·hcl、1.2mgdmap加至上述溶液中，室温氮气避光条件下反应72h。减压干燥除去溶剂dcm，然后将干燥产物置于硅胶柱内，干法上样，用配比为乙醇：氯仿＝1:4的流动相洗脱，点板观察以收集产物，合并洗脱下来的产物并做减压蒸干处理。所得产物经质谱鉴定，结构表征如图6所示，无目标产物的分子离子峰908.3561。

实施例4

dox-nlg919缀合物体内抑制乳腺肿瘤的生长

为了评估dox-nlg919缀合物在体内抑制肿瘤生长的效力，建立一个乳腺癌的动物模型。在balb/c小鼠的第四乳房垫下注射4t1细胞，4t1细胞在balb/c小鼠体内自发产生肿瘤，且这种肿瘤的特性与人体中的乳腺癌十分相近。将注射过4t1细胞的balb/c小鼠每周两次使用dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗，以及用pbs对照治疗。虽然在pbs对照组中小鼠的肿瘤大小在第七天显著增加，但在整个治疗过程中，用dox和nlg919治疗的小鼠中的肿瘤生长被抑制，用dox-nlg919缀合物治疗的小鼠中的肿瘤生长被显著消除(图7)。并且对使用dox、nlg919、dox-nlg919缀合物以及用pbs对照治疗后的小鼠体内的肿瘤进行荧光定量检测(图8)，检测到使用dox-nlg919缀合物治疗的小鼠体内荧光定量最弱(图9)、肿瘤体积定量最小(图10，图11)。这些结果证明了dox-nlg919缀合物在体内治疗乳腺肿瘤的强效力和功效。

与来自pbs治疗的对照组的那些相比，使用dox、nlg919、dox-nlg919缀合物治疗的小鼠的平均重量没有显著降低(小于15％的损失)(图12)，表明dox-nlg919缀合物在体内具有良好的耐受性。

实验例5

dox-nlg919缀合物的体外抗肿瘤活性试验

将4t1细胞接种于96孔板上(8000cells/wel1)，每孔体积100μl，接种后，将96孔板于37℃、体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中培养过夜，加入100μl的dox、nlg919、dox-nlg919缀合物(浓度范围为0-18μg/ml)。于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养48h后，每孔加入10μlcck-8溶液，于37℃、5％的二氧化碳的培养箱中培养2h，用酶联免疫检测仪于450nm处测其吸光度值，计算细胞存活率。结果如图13所示，从测定结果得dox、nlg919、dox-nlg919缀合物对4t1细胞的增值均有较好的抑制作用，但dox-nlg919缀合物对4t1细胞抑制作用比游离的dox和nlg919更强。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。