一种优化谷氨酸发酵的方法与流程

本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种优化谷氨酸发酵的方法。

背景技术：

发酵工程是利用生物（主要是微生物）和有活性的离体酶的某些功能，为人类生产有用的生物产品，或直接用微生物参与控制某些工业生产过程的一种技术。人们熟知的利用酵母菌发酵制造啤酒、果酒、工业酒精，乳酸菌发酵制造奶酪和酸牛奶，利用真菌大规模生产青霉素等都是这方面的例子。随着科学技术的进步，发酵技术也有了很大的发展，并且已经进入能够人为控制和改造微生物，使这些微生物为人类生产产品的现代发酵工程阶段。但是无菌环境仍然是最适发酵条件中的至关重要的一个，保持严格的无菌生长环境的手段，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术。

谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解代谢营养物质、合成所需产物、谷氨酸的生化过程。在这个过程中，影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多，通过人工干预有目的地控制这些因素，使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要，可以达到增加产物"降低消耗的目的。谷氨酸产生菌既是反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂，它摄取原料的营养，通过细胞内特定的酶系列进行复杂的生化反应。其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内，在酶的作用下进行催化反应，将反应物转化为产物并释放出来，细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。因此，发酵是一个比其他工业过程更为复杂的动态过程。

谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(emp途径)和己糖磷酸支路(hmp途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶a(乙酰coa)，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有nh⁴⁺存在的条件下，生成谷氨酸。

发酵法生产谷氨酸的过程中需要加碱调节ph来维持菌体的最适生长ph。目前能实现工艺要求的ph调控主要采用氨水调节，不需要消耗大量的试剂，生成的副产物少，具有闭合、清洁、廉价和高效等优点。谷氨酸棒杆菌高密度发酵条件下，伴随有谷氨酸的大量合成，会使ph迅速下降，需要通过流加氨水或液氨控制ph在7.0以上，铵盐可以作为发酵过程中的营养物和缓冲剂，但高浓度的nh⁴⁺会严重抑制谷氨棒杆菌的生长。

味精生产企业正向大型化、集约化发展，生产水平不断提高，但是与一些西方国家比较，我国的生产效率还有待进一步提高，生产成本也急需进一步降低，因此，提高谷氨酸发酵产酸率是一个亟待解决的问题。在谷氨酸发酵生产过程中,需要消耗大量的葡糖糖供菌体生长利用，发酵前期，糖的消耗用于菌体生长；发酵中后期，糖的消耗用于合成谷氨酸。如何对发酵培养进行进一步地优化，旨在提高发酵效率，是谷氨酸生产企业需要不断研究的技术问题。

技术实现要素：

在现有技术的基础上，申请人针对微生物发酵的特点，继续进行了改进，以提高发酵效率，据此，提出了一种优化谷氨酸发酵的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一种优化谷氨酸发酵的方法，其包括流加包含钙盐的培养液的步骤。

进一步地，所述钙盐为氯化钙。

进一步地，所述氯化钙在培养液中的浓度为5-15g/l。

进一步地，所述培养液中还包含乙烯利。

进一步地，所述培养液的组分为：氯化钙5-15g/l，乙烯利5-15mg/l。

进一步地，所述培养液的组分为：氯化钙10g/l，乙烯利10mg/l。

优选地，所述培养液在发酵6-12h时进行流加。

更优选地，所述培养液在发酵12h时进行流加，流加速度为0.02-0.03ml/min.l，直至发酵结束。

具体地，所述方法具体包括如下步骤：

将产谷氨酸的菌株种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在20-25％；整个发酵过程中，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水控制发酵液的ph值至7.0。

优选地，所述发酵培养基的制备方法为：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/l，酵母浸膏20g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o50mg/l，mnso4·h2o3mg/l，feso4·7h2o3mg/l，vb110mg/l，生物素7μg/l；将各原料搅拌均匀后，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：通过外加钙离子和乙烯利，能够提高细胞内钙调素的合成，在高钙条件下，钙调素能够与钙调素形成复合物，对乳酸脱氢酶有较强的激活作用，从而促进乳酸脱氢酶活性提高；乳酸脱氢酶能够将乳酸转化为丙酮酸和nadh，通过提高乳酸脱氢酶活性，能够降低副产物乳酸的产量，提高丙酮酸和nadh，为谷氨酸合成提供了必要的前提物质和能量，有利于谷氨酸合成量的增加，糖酸转化率也相应提高。钙调素复合物也可能通过与调节细胞分离的受体蛋白进行结合，通过促进菌体增殖来提高产酸量。本发明通过在发酵中期添加氯化钙和乙烯利的组合营养液，相互协同，能够大幅提高谷氨酸产量和糖酸转化率。

附图说明

图1：氯化钙添加浓度和时机对糖酸转化率的影响；

图2：氯化钙浓度对谷氨酸产量的影响；

图3：乙烯利浓度对糖酸转化率的影响；

图4：乙烯利浓度对谷氨酸产量的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种优化谷氨酸发酵的方法，其包括如下步骤：

将黄色短杆菌gdk-9按8％接种量将种子液接入装有600l发酵培养基的1000l全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为od600nm为0.9，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在25％；整个发酵过程中，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水控制发酵液的ph值至7.0；

所述发酵培养基的制备方法为：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/l，酵母浸膏20g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o50mg/l，mnso4·h2o3mg/l，feso4·7h2o3mg/l，vb110mg/l，生物素7μg/l；将各原料搅拌均匀后，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

发酵至12h时，按照0.03ml/min.l（每升发酵液中每分钟流加0.03ml）的流加速度向发酵培养基中添加培养液，直至发酵结束；所述培养液的组分为：氯化钙10g/l，乙烯利10mg/l。

实施例2

一种优化谷氨酸发酵的方法，其包括如下步骤：

将黄色短杆菌gdk-9按8％接种量将种子液接入装有600l发酵培养基的1000l全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为od600nm为0.9，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在20-25％；整个发酵过程中，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水控制发酵液的ph值至7.0-7.2；

所述发酵培养基的制备方法为：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/l，酵母浸膏20g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o50mg/l，mnso4·h2o3mg/l，feso4·7h2o3mg/l，vb110mg/l，生物素7μg/l；将各原料搅拌均匀后，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

发酵至12h时，按照0.02ml/min.l（每升发酵液中每分钟流加0.02ml）的流加速度向发酵培养基中添加培养液，直至发酵结束；所述培养液的组分为：氯化钙15g/l，乙烯利15mg/l。

对比例1

一种优化谷氨酸发酵的方法，其包括如下步骤：

将黄色短杆菌gdk-9按8％接种量将种子液接入装有600l发酵培养基的1000l全自动发酵罐中进行发酵培养，菌体的接种浓度为od600nm为0.9，发酵48h，收集发酵液；整个发酵过程中，控制发酵温度35℃，通风比1∶0.7，搅拌转速300r/min，溶氧维持在25％；整个发酵过程中，流加质量百分比浓度为50％的葡萄糖维持残糖不低于1.0％，流加消泡剂消泡，同时流加氨水控制发酵液的ph值至7.0；

所述发酵培养基的制备方法为：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖80g/l，酵母浸膏20g/l，k2hpo42g/l，mgso4·7h2o50mg/l，mnso4·h2o3mg/l，feso4·7h2o3mg/l，vb110mg/l，生物素7μg/l；将各原料搅拌均匀后，121℃灭菌15min，自然冷却，即得发酵培养基。

实施例3

培养液对谷氨酸产量和糖酸转化率的影响。

1、考虑到额外流加的液体对发酵液会有稀释作用，造成谷氨酸发酵浓度下降，因此，控制发酵液的总体积较为重要，综合考虑，一般不超过10%，以4-7%较为合适。因此，本试验选择0.02-0.03ml/min.l的流加速度；以0.03ml/min.l的流加速度为例检测培养液对谷氨酸产量和糖酸转化率的影响；发酵前期以菌株增值为主，中后期以产酸为主，此时乳酸是主要的副产物，因此，选择在发酵中期开始流加培养液较为合适。在对比例1的基础上，设置营养液的组分氯化钙，浓度梯度为：1,2.5，5,10,15,20,30，单位g/l，如图1所示，横向观察，随着浓度的增大，糖酸转化率有所提高，10-15g/l的浓度对糖酸转化率的提高幅度较大，继续增加氯化钙浓度，对糖酸转化率影响应不大；纵向观察，选择6,12小时流加氯化钙对糖酸转化率的影响最大，二者没有明显差异，考虑到流加总体积，选择12h氯化钙10g/l的量进行流加较为合适；12h时，谷氨酸产量的变化趋势和糖酸转化率保持一致，见图2，氯化钙为10g/l时的谷氨酸产量为138.1g/l，较对比例1（127.2g/l）提高了8.57%。

2、选择发酵至12h时以氯化钙10g/l的浓度进行流加，在此基础上添加乙烯利，设置乙烯利的浓度为1,2.5,5,10,15,20,30，单位mg/l，如图3-4所示，随着乙烯利浓度的增加，糖酸转化率和谷氨酸产量均有所提高，乙烯利浓度为10mg/l时，糖酸转化率接近峰值，而此时谷氨酸产量最大，可达到145.9g/l，较未添加乙烯利时能提高5.65%。

通过外加钙离子和乙烯利，能够提高细胞内钙调素的合成，在高钙条件下，钙调素能够与钙调素形成复合物，对钙调素对乳酸脱氢酶有较强的激活作用，从而促进乳酸脱氢酶活性提高；乳酸脱氢酶能够将乳酸转化为丙酮酸和nadh，通过提高乳酸脱氢酶活性，能够降低副产物乳酸的产量，提高丙酮酸和nadh，为谷氨酸合成提供了必要的前提物质和能量，有利于谷氨酸合成量的增加，糖酸转化率也相应提高。钙调素复合物也可能通过与调节细胞分离的受体蛋白进行结合，通过促进菌体增殖来提高产酸量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。